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目前，环境内分泌干扰物(endocrine disrupting chemicals，EDCs)对人类和野生生物的有害影响引起了许多国际组织和世界各国政府的关注，成为本世纪生命科学和环境科学的重大议题之一。对EDCs内分泌扰乱研究，在陆生动物方面主要集中在雄性或雌性动物生殖功能的影响、癌症细胞的增殖效应等方面；在水生动物研究方面，主要集中在对鱼类的氧化毒性和雌激素效应以及蛋白生物标志物上。对壬基酚(4-Nonylphenol，NP)和双酚A(Bisphenol A，BPA)的生物毒性评价迫切需要能够反映NP和BPA在环境中的实际毒性效应的方法，但是NP和BPA的化学分析方法费时费力、费用昂贵。因此，研究NP和BPA的生物分析方法成为了生态毒理学领域的一个热点，本文研究了NP和BPA对鲫原代培养肝细胞的毒性作用和雌激素效应。
一、 采用Percoll法建立鲫肝细胞原代培养模型
建立从非实质细胞和血细胞中分离得到高纯度和活力肝实质细胞的方法是对硬骨鱼类肝细胞研究的前题条件。本实验用percoll液密度梯度离心的方法分离得到了高纯度和活力的肝实质细胞。以Ⅳ型胶原酶消化法分离鲫肝细胞，然后将其分成2组，1组不再经过进一步处理(即对照组)；另1组再用Percoll液密度梯度离心纯化肝细胞(即实验组)，然后将两组细胞接种于DMEM/F12培养基中培养10d。在倒置显微镜下观察两组肝细胞的形态并绘制细胞生长曲线；采用台盼蓝染色法比较两组肝细胞的存活率；通过H.E染色法在光镜下检测肝细胞的纯度；采用MTT比色法测定两组肝细胞的增殖率；收集肝细胞培养上清液检测白蛋白、尿素以及乳酸脱氢酶的水平以检测两组肝细胞功能。结果表明，对照组鲫肝细胞存活率为80.6％，纯度为83.2％；实验组肝细胞存活率和纯度明显高于对照组(P<0.05)，分别为94.2％和95.1％。从开始接种到大部分肝细胞贴壁生长，实验组比对照组肝细胞的增殖明显加快(P<0.05)。白蛋白分泌功能、尿素合成能力及乳酸脱氢酶检测结果表明，实验组培养上清液中白蛋白分泌量、尿素合成能力明显高于对照组(P<0.05)；而乳酸脱氢酶含量明显低于对照组(P<0.05)。
二、 壬基酚和双酚A对鲫原代培养肝细胞毒性作用
用10<-4>mol/L、10<-5>mol/L、10<-6>mol/L、10<-7>mol/L、10<-8>mol/L NP和BPA分别暴露鲫原代培养肝细胞48h，用MTT法测定NP和BPA对肝细胞生长抑制影响；测定培养基中乳酸脱氢酶(LDH)含量，分析NP和BPA对肝细胞膜损伤的影响；测定肝细胞丙二醛(MDA)和谷胱甘肽-S转移酶(GST)的含量，分析NP和BPA对肝细胞氧化损伤作用；用荧光分光光度计测定肝细胞EROD的含量，建立NP和BPA对肝细胞EROD诱导的剂量效应关系。结果表明当NP浓度≥10<-7>mol/L或BPA浓度≥10<-5>mol/L时肝细胞活力明显降低(P<0.05)。当NP浓度≥10<-7>mol/L或BPA浓度≥10<-6>mol/L时肝细胞LDH漏出量明显增加(P<0.05)。当NP浓度≥10<-7>mol/L或BPA浓度≥10<-6>mol/L时肝细胞MDA含量明显增加(P<0.05)。当浓度≥10<-7>mol/L时，NP和BPA均能引起肝细胞氧化损伤使GST酶含量增加(P<0.05)。当NP浓度≥10<-8>mol/L或BPA浓度≥10<-7>mol/L时与对照组相比肝细胞EROD含量明显增加。NP和BPA对EROD诱导的EC<,50>分别是277nmol/L，1261nmol/L；剂量效益曲线方程为分别为：NP：Y=3.86781n(X)+15.523；R<2>=0.9721BPA：Y=4.51021n(X)+3.5501；R<2>=0.9642 由以上结果可知NP对肝细胞的毒性作用强于BPA,对EDCs的检测灵敏度强弱依次为：EROD>GST>MDA，LDH。
三、 壬基酚和双酚A对鲫原代培养肝细胞卵黄蛋白原的诱导
卵黄蛋白原(VTG)作为检测环境雌激素生物标志物的研究已成为生态毒理学研究的热点。在雌激素诱导下，鱼类肝脏VTG mRNA表达敏感性高、受外界干扰小，因此，鱼肝脏VTG mRNA可以作为一种新的标志物而应用到环境雌激素的检测中去。
本实验用10<-7>mol/L、10<-5>mol/L NP和10<-6>mol/L、10<-4>mol/L BPA分别暴露作用鲫原代培养肝细胞48h，用Trizol法提取肝细胞总RNA，用自己设计的引物，通过RT-PCR.的方法检测肝细胞VTG mRNA表达量的变化，结果表明以上浓度NP和BPA均能诱导肝细胞VTG mRNA表达量增加，表现出雌激素效应。因此可以用原代培养肝细胞的办法来检测NP和BPA的雌激素效应。