背景:传统认为1型糖尿病的主要发病原因是胰岛β细胞的自身免疫反应,而2型糖尿病的主要病因是胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)。众所周知,糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是发达国家终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)的首要病因。早期2型DN在临床上以IR和微量白蛋白尿(microalbuminuria,MAU)为标志。IR作为MAU的独立危险因素,是导致2型糖尿病高糖状态的直接原因。IR和MAU可以出现在糖尿病发生之前,导致肾脏的病理改变。与1型糖尿病胰岛素依赖疗法不同,2型糖尿病以治疗IR为主,从而改善高胰岛素血症和高糖血症。脂氧化酶(lipoxygenase,LO)是一组不含血红素铁的蛋白家族,立体特异地将氧分子插入含不饱和脂肪酸的1,4-顺式,顺式-戊二烯中。根据氧原子插入花生四烯酸的碳末端的位置不同,LO被分为5-,8-,12-和15-LO。12-LO以花生四烯酸为基质生成12(S)-氢氧化二十碳四烯酸[12(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid,12(S)-HETE]。研究表明12-LO和12(S)-HETE在DN中起重要调节作用。抑制12-LO可以显著降低2型糖尿病中MAU,却不能降低1型糖尿病中MAU。在2型糖尿病患者中,IR是MAU独立危险因素。此外,研究发现12-LO在IR病理生理过程中被激活,且12-LO可以促进由高脂饮食诱导的IR,然而12-LO是否可以通过改善IR而延缓MAU的进展尚不清楚。研究表明代谢综合征时肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)的失调可促进2型糖尿病的发生、发展。血管紧张素Ⅱ1型受体(angiotensinⅡtype 1receptor,AT1R)是血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)生理功能的主要介导受体之一。研究发现AT1R与IR的病理过程有关。12-LO和AT1R的相互作用可以促进DN的发生和发展。血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI)和血管紧张素受体拮抗剂(angiotensin receptor blocker,ARB)被证实有降低尿蛋白和提高胰岛素敏感性的作用。基于上述,我们假设2型DN时抑制12-LO可以改善IR,从而下调肾小球内AT1R表达而延缓MAU的进展。方法:1.用胰岛素(10-6 mol/L)处理大鼠系膜细胞24 h,收集细胞检测AT1R蛋白表达。2.用12(S)-HETE(10-7 mol/L)或p38丝裂原蛋白活化激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)抑制剂SB202190(10-6 mol/L)处理大鼠系膜细胞,收集细胞检测AT1R相关蛋白(AT1R associated protein,ATRAP)蛋白表达。3.采用皮下包埋的微型渗透泵给大鼠持续恒速注入12(S)-HETE(1 mg/kg/d),对照组大鼠泵注乙醇胺。7天后处死大鼠,提取肾小球,检测肾小球内AngⅡ、AT1R及ATRAP表达。4.采用皮下包埋的微型渗透泵给野生型(WT)和12-LO基因敲除(LOKO)小鼠持续恒速注入AngⅡ(1.1 mg/kg/d),对照组WT和LOKO小鼠分别泵注乙醇胺。14天后处死小鼠,提取小鼠肾脏并检测肾小球内AT1R的m RNA表达。5.采用一次性大剂量链脲佐菌素(streptozocin,STZ)(200 mg/kg,腹腔注射)法诱导1型糖尿病小鼠模型。野生型和12-LO基因敲除C57BL/6小鼠,分为四组:野生型对照组(WT),12-LO基因敲除组(LOKO),野生型糖尿病组(WT+STZ)和12-LO基因敲除糖尿病组(LOKO+STZ)。6周后处死小鼠,实验期间连续监测小鼠空腹血糖,收集24 h尿液。6.采用大剂量STZ(65 mg/kg,腹腔注射)诱导1型糖尿病大鼠模型,糖尿病模型成功后随机分为2组:1型糖尿病肾病组(T1DN)和CDC(cinnamyl-3,4-dihydroxy-α-cynanocinnamate,12-LO抑制剂,腿部皮下注射,8 mg/kg/d,3次/周)治疗组(CDC)。以规律正常饮食大鼠作为对照组。6周后处死大鼠,实验期间连续监测大鼠空腹血糖,收集24 h尿液,提取大鼠肾脏,分离肾小球并检测肾小球内AT1R的表达。7.采用高脂饮食结合小剂量STZ(35 mg/kg,腹腔注射)的方法诱导2型糖尿病大鼠模型,模型成功后将大鼠随机分为2组:2型糖尿病肾病组(T2DN)和CDC(腿部皮下注射,8 mg/kg/d,3次/周)治疗组(CDC)。以规律正常饮食大鼠作为对照组。6周后处死大鼠,实验期间连续监测大鼠空腹血糖,每两周检测大鼠空腹胰岛素水平,计算胰岛素敏感指数,收集血液和24 h尿液,提取大鼠骨骼肌和肾脏,分离肾小球。检测肾小球内AT1R表达和AngⅡ含量;检测骨骼肌内腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)和p-AMPK水平;过碘酸-希夫氏(periodic acid schiff,PAS)染色观察肾组织结构。采用系列过筛法分离肾小球,酶联免疫吸附检测法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测AngⅡ及尿白蛋白水平,放射免疫法检测空腹胰岛素水平,蛋白印迹法(western blot)、逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测相关蛋白和m RNA表达,PAS染色观察肾组织结构。结果:1.对照组大鼠肾小球结构基本正常,T2DN组大鼠肾小球的毛细血管球明显肥大,肾小囊腔变小,系膜基质增多。CDC治疗6周后,糖尿病大鼠肾小球体积缩小,系膜基质积聚的现象较T2DN组大鼠有所缓解。与对照组相比,T2DN组大鼠肾小球体积明显增加(P<0.01),CDC治疗后糖尿病大鼠肾小球体积降低(P<0.05)。2.与WT+STZ组相比,LOKO+STZ组小鼠血糖在STZ注射后第2、3周明显降低(P<0.01)。与T1DN组相比,CDC组大鼠血糖在第2、3周降低,但二者无统计学差异。与1型糖尿病大鼠模型相似,CDC治疗2型糖尿病大鼠血糖在第2、3周时较T2DN组降低,但二者无统计学差异。3.与WT组和LOKO组分别相比,WT+STZ组和LOKO+STZ组小鼠MAU显著增加(P<0.01),但LOKO+STZ组和WT+STZ组相比较MAU无显著变化。与对照组相比,T1DN组大鼠和T2DN组大鼠MAU明显增加(P<0.01),CDC不能延缓1型糖尿病大鼠MAU的发展但可以降低2型糖尿病大鼠MAU(P<0.05)。4.在2型糖尿病模型成功后第2、4、6周,与对照组相比,T2DN组大鼠空腹胰岛素水平显著增加(P<0.01),胰岛素敏感指数明显下降(P<0.01)。在第6周CDC治疗使糖尿病大鼠空腹胰岛素水平明显下降(P<0.05),胰岛素敏感指数明显增加(P<0.05)。2型糖尿病大鼠与对照组相比骨骼肌内p-AMPK水平明显下降(P<0.01),CDC治疗后p-AMPK基本恢复到正常水平(P<0.05)。5.用微型渗透泵给大鼠皮下泵注12(S)-HETE后,大鼠肾小球内AngⅡ水平明显增加(P<0.01)。与对照组相比,T2DN组大鼠肾小球内AngⅡ水平增加(P<0.01),CDC治疗后2型糖尿病大鼠肾小球内AngⅡ水平降低(P<0.05)。6.与WT组相比,LOKO组小鼠AT1R表达减低。用微型渗透泵给WT组和LOKO组小鼠皮下泵注AngⅡ后,两组小鼠肾小球内AT1R表达减少。7.用微型渗透泵给大鼠皮下泵注12(S)-HETE后,大鼠肾小球内AT1R表达水平明显升高(P<0.01),ATRAP表达明显降低。12(S)-HETE直接刺激大鼠系膜细胞诱导ATRAP蛋白表达降低(P<0.01)。在SB202190的作用下,12(S)-HETE诱导降低的ATRAP蛋白表达显著增加(P<0.05)。8.胰岛素刺激大鼠系膜细胞可诱导AT1R蛋白表达增高(P<0.01)。9.与对照组相比,T1DN组大鼠肾小球AT1R表达降低,但无统计学意义,CDC治疗对1型糖尿病大鼠肾小球AT1R无显著影响。与对照组相比,T2DN组大鼠肾小球AT1R表达(P<0.01),ATRAP表达减少(P<0.01)。CDC治疗后2型糖尿病大鼠肾小球AT1R表达减少(P<0.05),ATRAP表达增加(P<0.05)。结论:1.抑制12-LO对1型和2型糖尿病大鼠血糖无影响;抑制12-LO可降低2型糖尿病大鼠MAU,但对1型糖尿病大鼠MAU无影响。1型和2型糖尿病的主要区别是IR,因此抑制12-LO通过改善IR降低2型糖尿病MAU。2.AT1R在2型糖尿病大鼠肾小球内增高,而在1型糖尿病大鼠肾小球内无变化,且IR诱导肾小球细胞内AT1R表达上调,因此抑制12-LO可以影响IR而调节AT1R表达水平。3.12-LO可通过p38MAPK信号通路调节肾小球内ATRAP水平,从而影响AT1R受体内化。4.抑制12-LO在2型DN时通过改善IR而降低肾小球内AT1R的水平,从而延缓MAU的进展。