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红花为菊科红花属植物红花(Carthamus tinctorius L.)的干燥花冠,是我国传统中药,具有抗肿瘤、抗氧化和抗炎等药理作用。黄酮醇及其糖苷类化合物是红花的主要活性成分之一。为探讨红花中黄酮醇苷的生物合成途径,本研究对红花黄酮醇苷代谢途径中的关键酶如黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)、黄酮醇合酶(flavonol synthase,FLS)及糖基转移酶(glycosyltransferase,GT)进行了挖掘并对其催化特性进行了系统性研究。研究结果如下:成功从红花中寻找并克隆了黄烷酮3-羟化酶(CtF3H)基因、黄酮醇合酶(CtFLS)基因及糖基转移酶(UGT88B2)基因,并在大肠杆菌中实现了基因的外源表达。红花黄烷酮3-羟化酶(CtF3H)能够催化黄烷酮类化合物的C-3位羟基化,生成二氢黄酮醇。选择多对手性异构体的黄烷酮类化合物对CtF3H的催化特点进行了考察,体外酶促反应结果表明:重组酶CtF3H可专一性识别S构型的多个黄烷酮类底物包括(2S)-柚皮素、(2S)-圣草酚、(2S)-甘草素、(2S)-橙皮素和(2S)-杜鹃素,高效生成相应的3位羟基化产物,转化率均大于70%,并且3位羟基的构型均为β构型,说明该酶不仅具有严格的位置选择性,而且具有严格的立体选择性。酶促反应产物的结构及构型是通过放大制备五个二氢黄酮醇产物,经MS、NMR及旋光度确定的。酶学性质研究表明,CtF3H最适温度为35℃,最适pH为7.0,依赖二价金属离子Fe2+。酶促反应动力学分析表明,最适条件下CtF3H对(2S)-柚皮素的KM值为16.2μM。红花黄酮醇合酶(CtFLS)能够催化二氢山奈酚和二氢槲皮素分别氧化脱氢形成对应的产物山奈酚和槲皮素。酶学性质研究表明,CtFLS在25℃,pH 6.0的条件下表现出较高的催化活性,且依赖二价金属离子Fe2+。酶促反应动力学分析表明,最适条件下CtFLS对(2R,3R)-二氢山奈酚的KM值为73.9μM。体外反应结果表明,重组糖基转移酶UGT88B2对多种结构类型的黄酮类化合物均具有较高的O-糖基化活性,而且能够催化一些底物形成多个糖基化产物,例如该酶不仅能够催化山奈酚形成3种单-O-葡萄糖苷,还可以形成至少2种双-O-葡萄糖苷。UGT88B2表现出高效、多样的催化性能,有望成为一种高效的生物催化剂,用于酶促合成各种生物活性糖苷类药物。酶学性质研究表明,UGT88B2在45℃,pH 8.0的条件下表现出较高的催化活性。酶促反应动力学分析表明,最适条件下UGT88B2对山奈酚的KM值为39.1 μM。在上述基础上,本研究将CtF3H、CtFLS和来源于紫苏(Perilla frutescens)的葡萄糖醛酸转移酶(UGT88D7)基因导入大肠杆菌中,构建了全细胞催化体系,能将柚皮素高效转化为具有蛋白酪氨酸磷酸酶PTP(1B)抑制活性的山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷。向体系中投入8 mg柚皮素,产物得率可达70%。综上所述,本论文从红花中克隆获得了 3个新基因并成功进行了外源表达,重组酶CtF3H、CtFLS、UGT88B2均具有良好的催化特点,可以作为工具酶用于黄酮醇及其苷类化合物的酶法合成。同时构建了由柚皮素高效生成山奈酚-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷全细胞催化体系。这些结果为活性黄酮醇及其糖苷类化合物的生物合成提供了实验依据,具有理论价值及实际应用潜力。