体外分化的胰岛素分泌细胞是糖尿病细胞治疗希望的来源。成体干细胞存在于胎儿胰腺导管组织中,并持续存在于成人胰管中,胰腺导管干细胞是胰腺内分泌祖细胞。胰岛细胞是在胰腺导管网络的发育过程中由上皮中发现的多能和双能祖细胞形成的。许多研究已经证实在成人胰腺的胰管中存在双能干细胞/祖细胞。此外,谱系追踪研究表明,这些祖细胞在胰腺损伤或应激时可产生新β细胞。许多研究人员使用胰腺导管干/祖细胞进行β样细胞的体外发育,该细胞可作为糖尿病患者的β细胞替代来源,因为它们在经典动物模型中具有胰腺内分泌细胞再生的潜力。然而,β细胞的体外发育需要复制其发育的信号通路,这是一项艰巨的任务。因此,体外产生的β样细胞不够成熟,直到最近才用作β细胞替代的临床选择。尽管如此,由于单细胞RNA测序等新的生物技术出现,30年来关于β样细胞体外发育的研究接近尾声,这帮助我们了解了内分泌细胞发育中所涉及的细胞过程。本实验室已从大鼠胰腺导管组织分离培养一例胰腺导管干细胞系（PDESCs）,并对其形态学特征、蛋白表达特性、细胞核型、多向分化性等进行了研究。本研究在已有大鼠胰腺导管干细胞系的基础上,分别比较在基础培养液中添加不同浓度INGAP-PP、Vit D3和NIC诱导大鼠胰腺导管干细胞分化形成胰岛β细胞的效果。筛选INGAP-PP、Vit D3和NIC的诱导浓度;以INGAP-PP、Vit D3和NIC最佳诱导浓度随机组合建立诱导方案,比较不同方案诱导大鼠胰腺导管干细胞分化形成胰岛β细胞的效果。我们分析了不同诱导组组的细胞形态、相关转录因子的基因表达以及糖刺激胰岛素分泌（GSIS）,以比较不同因子单独和组合对PDSC分化为β样细胞的影响。本研究分为四个部分:试验1:INGAP-PP体外诱导大鼠胰腺导管干细胞分化形成胰岛β细胞本研究旨在比较基础培养液中添加不同浓度INGAP-PP对诱导大鼠胰腺导管干细胞分化形成胰岛β细胞的影响。培养并扩增第12代PDESC,以1×10~4细胞/孔接种到12孔板中。不同的试验组包括,一个对照组和四个INGAP-PP诱导组,每个组有36个重复。其中包括一个对照组和四个INGAP-PP诱导组。以（DMEM/F12+10%FBS+1%青霉素-链霉素）为基础培养液,诱导组分别在基础培养液的基础上添加100n M、150n M、200n M和250n M的INGAP-PP。细胞在37℃,5%CO2培养箱中培养28天。在28天的诱导后,使用DTZ染色、q PCR、免疫荧光和GSIS检查诱导细胞的INS1和Pdx1 m RNA表达水平、胰岛素和Pdx1蛋白的细胞内表达以及胰岛素和C肽的分泌量。结果表明,INGAP诱导组的诱导细胞生长像具有DTZ染色阳性细胞的ICC,而对照组没有发展成胰岛β细胞。此外,INS1和Pdx1在INGAP补充组中的m RNA表达明显高于对照组（p<0.01）,ICC中的诱导细胞显示胰岛素和Pdx1共同表达。当INGAP诱导组的诱导细胞暴露在低糖和高糖下时,它们分泌的胰岛素和C肽水平显著高于对照组（p<0.01）。上述试验结果表明,150n M INGAP-PP能够有效地诱导PDESC分化成胰岛素分泌β样细胞。该组细胞团的大小大于其他诱导组,胰岛素、Pdx1 m RNA和蛋白质的表达也很高,诱导的ICC在低糖和高糖条件下分泌更多的胰岛素和C-肽。试验2:NIC体外诱导大鼠胰腺导管干细胞分化形成胰岛β细胞这项研究的目的是确定将成年大鼠PDESC分化成β样细胞的最佳NIC浓度。在这个实验中,取12代大鼠胰腺导管干细胞,按1×10~4个/孔接种于12孔板中。总共接种15个12孔板,分别设置对照组和4个不同浓度NIC诱导试验组,每组3个12孔板,共36个重复孔。对于对照组,基础培养液（DMEM/F12+10%FBS+1%青霉素-链霉素）被用作诱导液,而对于四个NIC诱导组,分别在基础培养液的基础上添加5m M,10m M,15m M和20m M的NIC。PDESC在37℃,5%CO2培养箱中培养28天,每三天用显微镜观察细胞的形态变化。DTZ染色、q PCR、免疫荧光和糖刺激试验分别用于识别诱导细胞INS1和Pdx1表达水平、细胞内胰岛素和Pdx1蛋白表达水平,结果显示,在28天诱导后释放胰岛素和C-肽。NIC诱导组的诱导细胞生长像胰岛素分泌细胞与DTZ染色阳性细胞,而对照组没有形成胰岛素分泌细胞。此外,NIC诱导组的INS1和Pdx1 m RNA表达率明显高于对照组（p<0.01）,诱导组中的细胞具有胰岛素和Pdx1共同表达。当NIC补充组的诱导细胞受到低和高血糖浓度的影响时,它们分泌的胰岛素和C-肽（p<0.01）明显多于对照组的胰岛素和C-肽释放量。这些结果表明,NIC可以诱导大鼠胰腺导管干细胞分化为β细胞,并且添加10m M NIC时诱导效果最佳。试验3:Vit D3体外诱导大鼠胰腺导管干细胞分化形成胰岛β细胞本研究旨在比较基础培养液中添加不同浓度Vit D3对诱导大鼠胰腺导管干细胞分化形成胰岛β细胞的影响。培养并扩展了第12代PDESC,以1×10~4细胞/孔接种到12孔板中。不同的试验组包括,一个对照组和四个vit D3诱导组,每个组有36个复制。诱导组由对照组的基础培养液（DMEM/F12+10%FBS+1%青霉素-链霉素）和4个vit D3诱导组在基础培养液中添加10-5mol/L、10-6 mol/L、10-7 mol/L和10-8 mol/L Vit D3。细胞在37℃,5%CO2培养箱中连续培养28天,每三天通过显微镜观察一次形态变化。在28d诱导后,分别进行了DTZ染色、q PCR、免疫荧光和糖刺激试验检测诱导细胞的INS1和Pdx1 m RNA的表达水平、胰岛素和Pdx1蛋白的细胞内表达以及释放胰岛素和C肽的水平。结果表明,vit D3诱导组的细胞生长起来就像含有DTZ染色正细胞的ICC,而对照组缺乏胰岛素分泌细胞的形成。此外,与对照组相比,Vit D3诱导组的INS1和Pdx1的m RNA表达显著高于对照组（p<0.01）,Vit D3补充组的类胰岛细胞团也对胰岛素和Pdx1具有免疫活性。当暴露在低血糖和高葡萄糖下时,如果胰岛素和C-肽与对照组相比,Vit D3中诱导的细胞分泌的含量要高得多。对Vit D3诱导组不同组间差异的分析表明,10-6 mol/L和10-7 mol/L vit D3组的细胞表现出较高的INS1表达,Pdx1分泌的胰岛素和C肽水平较高。因此,在基本培养基介质中添加vit D3可导致从PDESC到β样细胞的分化,为此优化浓度为10-6 mol/L和10-7 mol/L。试验4:INGAP-PP、NIC和Vit D3联合诱导大鼠胰腺导管干细胞分化形成胰岛β细胞本研究旨在比较不同组合INGAP-PP,NIC和vit D3对诱导大鼠胰腺导管干细胞分化形成胰岛β细胞的影响。培养并扩增第12代PDESC,以1×10~4细胞/孔接种到12孔板中。每个试验组有36个重复,其中包括一个对照组和I+V、N+V、N+I和N+I+V诱导组。对于对照组,基础培养液（DMEM/F12+10%FBS+1%青霉素链霉素）被用作诱导液,而对于I+V、N+V、N+I、和N+I+V诱导组,在基础培养液基础上添加150n M ING+10-7M Vit D3,10-7M NIC+10-7M Vit D3,10m NIC+150n M ING,以及10m NIC+150n M ING+10-7M Vit D3。PDESC在37℃,5%CO2培养箱中培养28天,并且每三天使用显微镜观察形态变化。经过28天的诱导,DTZ染色、q PCR、免疫荧光和GSIS用于识别诱导细胞,测量INS1和Pdx1表达水平,可视化细胞内胰岛素和Pdx1蛋白质,并分别量化释放的胰岛素和C肽。I+V、N+V、N+I和N+I+V组的诱导细胞与上岗第28天的ICC相似,对DTZ染色呈染色阳性。胰岛素和Pdx1也在I+V、N+V、N+I和N+I+V组的细胞中共同表达。但是,与对照组、I+V组和N+V组相比,INS1和Pdx1的m RNA表达水平显著较高（p<0.01）。此外,N+I组的INS1和Pdx1表达水平高于N+I+V组。当N+I和N+I+V组的诱导细胞暴露在低和高血糖浓度下时,GSIS检测显示,它们释放出的胰岛素和C肽含量较高。因此,Nicotinamide（10m M）+INGAP（150n M）的组合诱导大鼠胰腺导管干细胞分化形成β细胞的诱导效果最好。