一、背景CD73是一种分子量为70kDa的多功能跨膜糖蛋白，通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）[1]锚定在细胞膜上。既往的研究表明，CD73在多种疾病中发挥多种不同生物学功能。CD73既具有细胞外水解酶的活性，如CD73可将细胞外的AMP水解成腺苷，腺苷再通过和四种不同亲和力的腺苷受体结合，参与多条不同信号转导通路，起到抑制血小板的聚集、抗炎症反应、免疫抑制等。同时，CD73还具有非水解酶的活性，近年较多报道指出，在乳腺癌、前列腺癌、恶性胶质瘤、膀胱癌等多种恶性肿瘤细胞中CD73的表达及活性显著升高[2]。有报道指出CD73在恶性黑色素瘤内高表达，并且CD73的高表达与其高侵袭性成正相关[3]。Rikke Leth-Larsen则报道了在高度恶性乳腺癌细胞的CD73mRNA水平和CD73活性均显著高于低度恶性细胞[4]，在进行了体外实验检测后发现，CD73可以促进人乳腺癌细胞的运动力和侵袭力，提示CD73在乳腺癌细胞的侵袭转移过程中发挥重要的作用。尽管如此，CD73在恶性肿瘤转移中的作用机制仍未阐明。CD73在结直肠癌细胞中的表达及其与临床病理参数之间的关系仍然不清楚。肿瘤的侵袭转移是恶性肿瘤患者死亡的重要原因，而恶性肿瘤细胞的运动、迁移、和侵袭贯穿于肿瘤转移的全过程，是肿瘤发生发展中最基本的生物学行为。鉴于此，我们预实验首先运用免疫组化检测了CD73在临床组织标本中的表达，发现与癌旁正常组织相比其结直肠癌细胞中高表达，并且在有淋巴结转移（C、D期）的病人组织标本中显著高表达于无淋巴结转移组，在随后通过RT-PCR及Western Blot检测结直肠癌细胞系CD73mRNA和蛋白水平的表达时，发现其在具有高侵袭潜能的细胞株中（Lovo、KM12）呈高表达。在用CD73特异性抑制剂αβ－亚甲基二磷酸腺苷（α-methyleneADP，APCP）作用于细胞系后，通过划痕实验及Transwell小室侵袭实验检测发现细胞运动、迁移、及侵袭能力均有不同程度下降，由此初步判断CD73与细胞的运动、迁移有关，但其具体作用及条件机制有待进一步研究。因此，本研究拟通过观察CD73对结直肠癌细胞侵袭力和运动力的影响，探讨CD73在结直肠癌转移过程中的作用及其机制，为进一步研究其在结直肠癌转移复发治疗中的作用奠定实验基础。二、目的明确CD73在不同分期的结直肠癌组织中的表达分布及其与临床病理参数、患者预后之间的相关性，以及CD73分子对结直肠癌细胞侵袭转移的促进作用，进一步阐明CD73促进结直肠癌细胞侵袭转移的相关分子机制。三、材料与方法1.采用免疫组化检测临床组织标本中结肠癌组织中CD73的分布与表达、并分析CD73的表达与各临床各病理参数的相关性，进一步运用Kaplan Meier生存曲线分析及多因素Cox回归模型预测CD73是否可以作为一个独立判断结直肠癌患者预后的因子。采用WB、RT-PCT检测手术后新鲜结直肠癌组织、癌旁正常组织和不同侵袭潜能的结直肠癌细胞系中CD73蛋白及mRNA水平的表达。2.体外采用特异性抑制剂、RNA干扰和基因过表达的方法，抑制结肠癌Lovo细胞CD73及上调RKO细胞的CD73表达，利用定量PCR、Western blot检测验证干扰及过表达后Lovo和RKO中CD73蛋白表达水平的改变，划痕实验、Transwell侵袭小室、细胞粘附实验体外检测上述CD73蛋白抑制或表达重建后Lovo和RKO细胞的ATP/ADP比值、运动、迁移、侵袭及粘附能力的改变。裸鼠体内移植瘤全身转移模型检测CD73干扰后肿瘤转移能力的改变。3.采用激光共聚焦观察CD73蛋白与阿糖腺苷受体A1R、A2AR、A2BR、A3R的共表达情况。定量PCR、WB检测CD73干扰后、其信号转导通路下游的阿糖腺苷受体A1R、A2AR、A2BR、A3R的mRNA和蛋白表达。将稳定转染CD73RNAi的Lovo细胞加入四种受体特异性激动剂后进行回复实验，利用Transwell侵袭小室实验检测分别用四种特异性受体激动剂刺激下游受体表达后结直肠癌细胞的迁移、侵袭能力的改变。四、结果1. CD73表达于结直肠癌细胞膜表面，396例的结直肠癌组织标本中，CD73阳性表达率为57.1%（226/396）。与癌旁正常结直肠组织相比，CD73在结直肠癌中的表达显著增高，并且在有淋巴结转移的患者中CD73表达显著高于无淋巴结转移患者，结果具有统计学差异（P<0.001）。CD73的高表达与淋巴结转移(P=0.020)、肿瘤分期成正相关(P=0.004)，与患者的年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤分化程度等无显著相关性。通过KaplanMeier生存曲分析结果表明CD73低表达的早期结直肠癌患者预后显著好于高表达患者。多因素Cox模型分析发现，CD73可以作为一个新的独立预测结直肠癌患者预后的因子。新鲜手术标本结直肠癌组织中CD73mRNA及蛋白表达水平显著高于其配对癌旁组织，且差异具有统计学意义。CD73在具有高侵袭潜能的结直肠癌细胞LOVO、KM12中有较高水平的表达，而在RKO、DLD1等细胞系中CD73的表达水平较低。2.用CD73的特异性免疫抑制剂抑制Lovo和KM12细胞中的CD73表达后，划痕实验和transwell侵袭小室结果显示，Lovo和KM12细胞的运动、迁移及侵袭能力均下降。构建CD73mRNA干扰慢病毒载体并成功转染至Lovo细胞后，划痕实验和transwell侵袭小室、粘附实验结果表明，Lovo细胞的运动、迁移、侵袭及粘附能力显著下降（P<0.01）。构建CD73mRNA过表达慢病毒载体并成功转染至RKO细胞后，划痕实验、transwell侵袭小室及粘附实验结果表明，RKO细胞的运动、迁移、侵袭及粘附能力显著升高(P<0.01)。体内实验结果显示，CD73可以促进结直肠癌细胞移植瘤的远处转移。3. CD73蛋白与A2AR、A2BR均存在着共表达，但在干扰沉默CD73表达后，阿糖腺苷A2BR受体mRNA及蛋白水平均下降，并且细胞的迁移、侵袭能力下降，而A2ARmRNA及蛋白水平均未见明显改变。在用A2BR的特异性激动剂激活A2BR受体后可以逆转性增强由沉默CD73表达后的Lovo细胞迁移及侵袭能力。五、结论1.与癌旁正常结直肠组织相比，CD73在结直肠癌组织的表达显著增高。在有淋巴结转移的患者中CD73表达显著高于无淋巴结转移患者，并且CD73的高表达与肿瘤分期、淋巴结转移能力呈正相关。CD73可作为早期结直肠癌患者的预后指标之一。2.体内体外实验均证实CD73具有促进结直肠癌细胞的侵袭转移作用。3. CD73通过调控A2BR的表达促进结直肠癌细胞的侵袭转移作用。