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研究背景：白血病(leukemia)是造血组织中某一系造血细胞受阻于特定分化阶段并克隆性扩增的造血系统肿瘤。根据白血病细胞的成熟程度及自然病程的长短,可将白血病分为急性白血病和慢性白血病,根据白血病细胞恶变的细胞系列可将其分为淋巴细胞白血病与非淋巴细胞白血病(又称髓系白血病)。急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia, ALL)是儿童期最常见的恶性肿瘤,以不成熟的白细胞的过量产生和聚积为特征。ALL患儿在化疗之后,超过80%-85%可以痊愈,然而,仍有20%-30%的患儿在化疗之后,仍会出现复发,且复发后预后极差,是儿童ALL治疗面临的主要挑战。急性髓细胞性白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一类高发于成人的造血系统恶性疾病,占白血病总发病率的50%以上,以白细胞异常迅速增长、积聚于骨髓并干扰正常白细胞产生为特征。探寻不同种类白血病的发病机制对更好的治疗具有重要意义。白血病干细胞(leukemia stem cell, LSC)是具有分化成造血系细胞能力的肿瘤干细胞,对白血病细胞的存活、增殖、转移及复发有着重要作用,被公认为是ALL治疗失败和复发的主要元凶。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BM-MSC)是骨髓微环境的重要组成部分,具有分化为特殊基质细胞的能力,并产生细胞因子、趋化因子,粘附分子和细胞外基质分子等造血过程必需的因子,因此是造血关键的调节因子。已有研究表明LSCs与BM-MSCs可相互作用,在白血病的发生发展中具有重要地位,而LSCs对BM-MSCs免疫表型和造血功能的影响及其机制目前尚不完全清楚。另一方面,BM-MSCs也被认为是机体最为重要的具有分化成多种类型成熟细胞的多能非造血干细胞,可保护肿瘤细胞发生免疫逃逸。研究显示AML来源的MSCs形态异常,骨髓微环境中MSCs的异常参与AML病理生理过程。外周血CD4+T淋巴细胞可通过接触依赖性和非接触依赖性机制对AML发挥强有力的抑制作用。而AML患者CD4+T淋巴细胞对MSCs增殖的影响目前还不清楚,其机制尚需进一步研究。目的：1.将B-ALL细胞系Nalm-6来源的LSCs与BM-MSCs共培养,评估LSCs对BM-MSCs的免疫表型和造血因子和差异基因表达的影响及其机制研究；2.研究AML患者CD4+T淋巴细胞对BM-MSCs增殖的影响及其机制研究。方法：1. B-ALL细胞系Nalm-6来源的LSCs对BM-MSCs生物特性的影响及其机制研究1.1 收集妊娠15-22周健康胎儿四肢进行骨髓样本采集和获取BM-MSCs,通过组织块培养法培养,光学显微镜和扫描电子显微镜观察BM-MSCs形态,流式细胞仪检测BM-MSCs免疫表型CD29,CD31,CD34,CD44,CD45,CD73,CD90和CD105的表达。1.2使用CD34免疫磁珠分离柱从Nalm-6细胞分离CD34+细胞,定义为LSCs,与BM-MSCs共培养24h-72h,流式细胞仪检测BM-MSCs细胞免疫表型,Real-time PCR方法检测BM-MSCs造血细胞调节因子SDF-1、IL-6、IL-10、G-CSF、IL-3、IL-7、SCF、IL-11、IL-1α、IL-1p和LIF转录水平的表达。1.3 LSCs与BM-MSCs共培养24h-72h后,采用Illumina Genome Analyzer/Hiseq2000分析BM-MSCs差异表达基因。根据RNA-Seq检测结果,使用real-time PCR对表达差异的基因进行验证。1.4构建lumican过表达载体pcDNA3.1-LUM/合成lumican干扰病毒siRNA-LUM(包括siRNA437和siRNA467),使用Lipofectamine2000将pcDNA3.1-LUM质粒和siRNA-LUM载体转染进BM-MSCs中, western blot验证转染后细胞lumican蛋白的表达。1.5 BM-MSCs转染pcDNA3.1-LUM或siRNA-LUM建立lumican过表达或者抑制细胞表达系,再与Nalm-6细胞共培养,流式细胞仪检测Nalm-6细胞的细胞周期、Annexin V/PI双染法结合流式细胞仪检测Nalm-6细胞凋亡、CCK-8法检测Nalm-6细胞对VP-16的敏感性。2.AML患者CD4+T淋巴细胞对BM-MSCs增殖的影响及其机制研究2.1收集20例AML患者和20例健康外伤者的骨髓,制备和培养BM-MSCs,光学显微镜观察两个组别的细胞形态,荧光标记的抗体结合流式细胞仪检测BM-MSCs免疫表型的表达,MTT法检测细胞增殖。2.2使用免疫磁珠分离AML患者外周血CD4+T淋巴细胞,流式细胞术进行鉴定,将AML来源的CD4+T淋巴细胞与正常人来源的BM-MSCs按照0：1、5：1、10：1以及20：1的不同比例进行共培养,MTT法检测细胞增殖。2.3收集AML患者和健康人来源的外周血CD4+T淋巴细胞,提取总RNA后,real-time PCR分别检测两组CD4+T淋巴细胞miR-10a的表达；2.4分离培养健康人来源BM-MSCs,转染miR-10a mimic和miR-10a inhibitor获得miR-10a过表达或者抑制细胞系,MTT法检测细胞增殖。AML来源的CD4+T淋巴细胞转染miR-10a antagomir获得miR-10a表达抑制细胞系,real-time PCR验证转染效率后取处理后的CD4+T淋巴细胞上清与BM-MSCs共培养,MTT检测BM-MSCs增殖；2.5生物信息学软件预测miR-10a与BCL6的3’-UTR的结合,构建BCL63’UTR荧光素酶报告质粒,BM-MSCs转染miR-10a mimic或者miR-10a inhibitor后,双荧光素酶报告基因检测BM-MSCs中荧光活性,评价miR-10a和BCL6 3’UTR的结合；BM-MSCs转染miR-10a mimic和miR-10a inhibitor, real-time PCR和western blot分别检测BCL6 mRNA和蛋白的表达：2.6收集20例正常人以及20例AML患者的血清和BM-MSCs, real-time PCR检测miR-10a表达；real-time PCR检测BCL6 mRNA表达；单因素相关性分析AML患者血清miR-10a表达与BM-MSC BCL6水平的相关性。结果：1 B-ALL细胞系Nalm-6来源的LSCs对BM-MSCs生物特性的影响及其机制研究1.1收集胎儿BM-MSCs,组织块培养法培养14天后,贴壁细胞出现骨髓间充质干细胞典型形态和特征,光学显微镜下表现为“双极纺锤状”和“旋涡状”成纤维细胞样,扫描电子显微镜确定了两种形态的细胞类型。流式细胞仪分析BM-MSCs免疫表型,发现CD29,CD44,CD73,CD90和CD105呈阳性,CD31,CD34和CD45呈阴性。1.2LSCs与BM-MSCs共孵育24h-72h后,流式细胞仪分析BM-MSCs表面分子,发现仅CD44在LSCs刺激后有显著变化,其他表面标记分子CD29,CD31,CD34,CD45,CD73,CD90和CD105在处理前后均无显著差异。Real-timePCR结果显示LSCs刺激后,BM-MSCs中SDF-1和IL-6 mRNA表达水平降低,IL-10、G-CSF、IL-3、IL-7、SCF、IL-11、IL-1α、IL-1p和LIF mRNA表达水平升高。1.3 BM-MSCs经LSCs处理后,Illumina Genome Analyzer/Hiseq 2000结果显示SLC7A5和TRIB3两个基因上调,WSB1, NKTR,LUM,OGT和LENG8这5个基因表达下调,根据以上RNA-Seq分析结果,real-time PCR验证发现TRIB3表达显著上调,而LUM和LENG8基因表达显著下调,这三个基因的改变与测序得到的结果一致,其中LUM的表达在LSCs处理前后变化最大,选LUM进行下一步研究。1.4 BM-MSCs转染pcDNA3.1-LUM后,lumican蛋白表达上调,是对照组的2倍多；BM-MSCs转染siRNA-LUM (siRNA437和siRNA467)后,lumican蛋白表达下调,且与siRNA467相比siRNA437转染的BM-MSCs, lumican蛋白下调更明显,因此,我们选siRNA437转染的BM-MSCs进行下一步研究。1.5 LUM表达抑制的BM-MSCs与Nalm-6细胞共孵育后, Nalm-6细胞在G0/G1期比例显著升高,而S期、G2/M期比例下降,细胞总凋亡率下降(13.96%比7.31%)。在对VP-16敏感性的实验中,发现转染siRNA-LUM-437可显著增加Nalm-6细胞存活率,与Nalm-6组和Nalm-6+normal BMSCs组相比对VP-16的敏感性降低；LUM过表达的BM-MSCs与Nalm-6细胞共孵育后,Nalm-6细胞在G0/G1期比例略有下降,而G2/M期比例略增加,细胞总凋亡率和细胞存活率无显著变化。2 AML患者CD4+T淋巴细胞对BM-MSCs增殖的影响及其机制研究2.1分离AML患者和健康人群BM-MSCs,光学显微镜发现AML患者中BM-MSCs细胞形态较对照组更稀疏和不均匀,流式细胞仪结果显示BM-MSCs表面阳性标记物CD73,CD90和CD105的阳性率均大于98%,阴性标志物CD45,CD14,CD19,CD34和HLA-DR阳性率均小于2%,细胞增殖曲线显示AML患者来源的BM-MSCs增长较为缓慢。2.2 AML患者CD4+T淋巴细胞与健康人来源BM-MSCs按照0：1、5：1、10：1以及20：1的比例共孵育,分别在0h、12h、24h以及48h时去除悬浮T细胞,结果发现CD4+T淋巴细胞可抑制BM-MSCs的增殖,且共孵育中CD4+T淋巴细胞的比例越高,增殖能力越低。2.3 Real-time PCR检测结果显示,较健康志愿者来源的CD4+T淋巴细胞相比,AML患者CD4+T淋巴细胞中miR-10a表达水平显著上调。2.4 miR-10a过表达可显著抑制BM-MSCs增殖,而miR-10a inhibitor促进BM-MSCs的增殖。AML来源的CD4+T淋巴细胞降低MSCs生长速率,CD4+T淋巴细胞转染niR-10a antagomir后,可逆转对MSCs生长抑制作用。2.5 microRNA.org预测发现miR-10a与BCL6的3’-UTR存在结合位点；荧光素酶报告基因法结果显示miR-10a mimic组中相对荧光值显著降低,而miR-10a inhibitor组中相对荧光值显著升高,提示BCL6是miR-10a的一个靶分子。BM-MSCs中miR-lOa过表达可显著下调细胞BCL6 mRNA和蛋白的表达,niR-10a抑制可显著上调BCL6 mRNA和蛋白表达。2.6 AML患者血清-niR-10a表达较健康志愿者血清miR-10a显著升高；AML患者来源BM-MSCs的BCL6 mRNA显著下调；单因素相关性分析结果表明AML患者血清miR-10a表达与BM-MSCs BCL6 mRNA水平存在显著负相关(R2=0.5777,P＜0.05)。结论：1. LSCs使BM-MSCs表面分子CD44发生变化,LSCs与BM-MSCs的相互作用可引起造血细胞调节因子复杂的改变。2. LSCs可诱导BM-MSCs出现多个基因表达差异,LUM编码的lumican变化最大,进一步实验证实下调lumican的BM-MSCs与Nalm-6细胞共培养后可减少Nalm-6细胞的凋亡,降低Nalm-6细胞对VP-16的敏感性,增加了Nalm-6细胞的生存率。3. AML患者CD4+T淋巴细胞可通过分泌miR-10a抑制BM-MSCs增殖,其中BCL6是miR-10a一个靶基因,miR-10a/BCL6通路可能是AML来源CD4+T淋巴细胞抑制BM-MSCs增殖的可能机制之一。