内侧内嗅皮层（Medial entorhinal cortex,MEC）在学习记忆中具有重要作用。MEC浅层神经元包括兴奋性的主要投射神经元和抑制性的中间神经元。其中,主要投射神经元可分为星状神经元和锥体神经元;中间神经元包括小清蛋白阳性（Parvalbumin,PV⁺）、生长抑素阳性（Somatostatin,SOM⁺）和5-羟色胺3A受体阳性(Serotonin receptor type 3A,5-HT_3AR⁺)中间神经元。MEC浅层神经元所构成的网络具有一个显著特征,即主要投射神经元之间极少形成相互联系,而是与中间神经元形成大量双向投射。神经元集群活动表现为局部场电位（Local field potential,LFP）的节律性振荡。Theta（4-12Hz）和gamma（25-120 Hz）振荡是MEC浅层与海马之间进行空间信息处理和传递的重要特征。学习记忆的完成是以高水平觉醒状态为前提的,而觉醒状态的维持依赖于脑内觉醒系统。觉醒肽（Hypocretin/orexin,Hcrt/orexin）能系统是脑内最重要的促觉醒系统之一。Hcrt系统是否调控MEC神经元活动并参与MEC相关的学习记忆行为及其机制目前仍不清楚。因此,本课题首次关注了Hcrt能系统在调控MEC神经元活动及其相关的空间学习记忆中的作用和机制。我们采用膜片钳技术、免疫组化及免疫电镜技术、病毒辅助的神经束路示踪技术、光遗传学和化学遗传学技术,并在特定的空间学习记忆任务中在体操控MEC浅层的Hcrt能纤维,详细研究了促觉醒Hcrt能系统调控MEC的机制及其在MEC相关的空间学习记忆中的作用。主要结果归纳如下:1.Hcrt1通过作用于HcrtR1兴奋MEC浅层中间神经元（1）Hcrt1通过Hcrt/orexin 1型受体（Hcrt/orexin receptor type 1,HcrtR1/OX₁R）增加MEC浅层中间神经元的放电频率。在电流钳模式下,我们发现灌流Hcrt1（500 nM）明显增加了PV⁺、5-HT_3AR⁺和SOM⁺中间神经元的放电频率(PV⁺中间神经元:P<0.05,n=8;SOM⁺中间神经元:P<0.01,n=9;5-HT_3AR⁺中间神经元:P<0.01,n=9)。而在HcrtR1阻断剂SB-334867（2μM）存在的情况下,Hcrt1增加中间神经元放电的效应消失（n=7）,这些结果提示Hcrt1通过作用于HcrtR1增加MEC浅层中间神经元放电。（2）Hcrt1增加MEC浅层中间神经元的兴奋性输入。神经元的兴奋性受到输入性突触传递的影响。我们发现谷氨酸能AMPA受体抑制剂CNQX（10μM）和NMDA受体抑制剂AP-5（50μM）可完全阻断Hcrt1对中间神经元的兴奋效应（n=9）。在电压钳模式下,Hcrt1（500 nM）显著增加了中间神经元自发性兴奋性突触后电流（Spontaneous excitatory postsynaptic currents,sEPSCs）的频率（P<0.05,n=8）,而不影响其幅度（n=8）。因此,Hcrt1通过作用于HcrtR1增加中间神经元的兴奋性输入,提高其兴奋性。2.Hcrt1增强MEC浅层兴奋性-抑制性神经元联系（1）Hcrt增强MEC浅层局部兴奋性-抑制性神经元之间的兴奋性突触传递。采用double-patch膜片钳记录,Hcrt1（500 nM）显著增加了主要投射神经元发放动作电位在PV⁺神经元、SOM⁺神经元以及5-HT_3AR⁺神经元上诱发产生的兴奋性突触后电流（Unitaryexcitatory postsynaptic currents,uEPSCs）的反应率(主要投射神经元-PV⁺神经元:P<0.01,n=5;主要投射神经元-SOM⁺中间神经元:P<0.05,n=3;主要投射神经元-5-HT_3AR⁺中间神经元:P<0.001,n=4)。这一结果直接表明,Hcrt1增强了MEC浅层兴奋性主要投射神经元与抑制性中间神经元之间的兴奋性突触传递效率。（2）HcrtR1表达于MEC浅层中间神经元突触前的谷氨酸能纤维末梢。免疫组化和免疫电镜的实验结果发现,在MEC浅层中间神经元突触前兴奋性轴突末梢中可观察到HcrtR1的分布,提示Hcrt1可能是通过作用于中间神经元突触前谷氨酸能末梢上的HcrtR1发挥效应。3.Hcrt1增加MEC浅层主要投射神经元的抑制性输入且依赖于完整的兴奋性突触传递（1）Hcrt1诱导MEC浅层主要投射神经元膜电位超极化并产生外向电流。在电流钳模式下,不管是星状神经元还是锥体神经元,Hcrt1（500 nM）均诱导了膜电位的超极化（星状神经元:P<0.001,n=23;锥体神经元:P<0.01,n=8）。与此一致,在电压钳模式下,Hcrt1（500 nM）诱使MEC浅层主要投射神经元产生明显的外向电流（P<0.001,n=16）。（2）Hcrt1增加MEC浅层主要投射神经元上的抑制性γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid,GABA）能输入。在GABAa受体阻断剂印防己毒素（Picrotoxin,PIC）（100μM）和GABAb受体阻断剂CGP-55845（2μM）存在的情况下,Hcrt1（500 nM）诱发主要投射神经元的超极化效应被完全阻断（n=8）,提示Hcrt1的这种效应依赖于GABA能突触传递。有趣的是,将脑片上兴奋性谷氨酸能AMPA受体和NMDA受体阻断后,灌流Hcrt1（500 nM）不影响自发性抑制性突触后电流（Spontaneous inhibitory postsynaptic currents,sIPSCs）的频率（n=7）和幅度（n=7）。我们将主要投射神经元的膜电位钳制在+10 mV,这既阻断了所记录神经元上谷氨酸受体的开放又保持了整个MEC浅层兴奋性谷氨酸突触传递的完整性。在这种记录模式下,Hcrt1（500 nM）显著增加了主要投射神经元上sIPSCs的频率（P<0.001,n=7）和幅度（P<0.05,n=7）。因此,在保持兴奋性谷氨酸能突触传递完整性的条件下,Hcrt1可显著增强MEC浅层主要投射神经元上的抑制性输入。4.内源性Hcrt调控MEC浅层神经元活动并增强gamma振荡（1）激活MEC浅层内源性Hcrt通过HcrtR1增加中间神经元放电。在Hcrt-cre小鼠的LH区注射顺行示踪的AAV-EF1α-DIO-mCherry后,可在MEC浅层观察到Hcrt能纤维的分布;在MEC浅层注射逆行传递AAV_retro-EF1α-EYFP后,可在LH区检测到病毒表达阳性的Hcrt神经元。因此,LH区的Hcrt神经元向MEC浅层发出直接纤维投射。我们将携带激活型光通道蛋白的病毒AAV-EF1α-DIO-ChR2-mCherry注射到Hcrt-cre小鼠的LH区使MEC浅层的Hcrt能纤维末梢表达光敏感的通道蛋白ChR2。光刺激（473 nm,20 Hz）激活内源性Hcrt释放后显著增加了MEC浅层PV⁺中间神经元放电频率（P<0.05,n=7）。HcrtR1阻断剂SB-334867可完全阻断这种光刺激增加中间神经元放电的效应（n=5）。因此,与外源性Hcrt的效应一致,内源性Hcrt通过作用于HcrtR1增强中间神经元兴奋性。（2）激活MEC浅层内源性Hcrt增加中间神经元的兴奋性输入。与离体脑片灌流Hcrt1的结果相一致,光刺激激活MEC浅层内源性Hcrt显著增加了中间神经元sEPSCs的频率（P<0.05,n=6）而不影响其幅度（n=6）。因此,内源性Hcrt可增强中间神经元的兴奋性输入,使其放电增加。（3）在体情况下激活MEC浅层内源性Hcrt增强中间神经元放电并抑制主要投射神经元放电。为了进一步阐明在体情况下内源性Hcrt对MEC浅层神经元的调控作用,我们利用多通道记录技术,观察了激活MEC浅层Hcrt能纤维对主要投射神经元和中间神经元放电的影响。结果发现,激活内源性Hcrt显著增加了中间神经元的放电频率（P<0.001,n=18）,并显著降低了主要投射神经元的放电频率（P<0.001,n=43）。（4）在体情况下激活MEC浅层内源性Hcrt增强gamma振荡。通过分析比较不同频率带的LFP,我们发现光激活MEC浅层内源性Hcrt不影响theta振荡的能量（n=27）,而显著增加了low-gamma（P<0.001,n=27）和high-gamma（P<0.01,n=27）振荡的能量。鉴于gamma振荡在MEC空间信息处理中的关键作用,我们推测,MEC浅层的内源性Hcrt很有可能通过影响神经元活动和网络振荡调控在体情况下MEC相关的空间认知功能。5.LH_Hcrt-MEC通路调控空间学习记忆（1）MEC浅层内源性Hcrt参与调控空间探索行为化学遗传学抑制MEC浅层内源性Hcrt损害小鼠空间探索行为。我们在小鼠LH区注射AAV-EF1α-DIO-hM4D-mCherry,并在MEC浅层注射叠氮平-N-氧化物（Clozapine N-oxide,CNO）实现化学遗传学抑制MEC浅层内源性Hcrt的释放,结果表明注射CNO显著增加了小鼠找到空间环境中正确食物位置的时间(P<0.001,n_mCherry=8,n_hM4D=8),且探索错误容器的次数显著高于对照组(P<0.01,n_mCherry=8,n_hM4D=8)。此外,抑制MEC浅层内源性Hcrt显著降低了空间探索行为中low-gamma振荡和high-gamma振荡的能量(Low-gamma:P_trial4,8,20<0.05,P_{trial 16}<0.01,n_mCherry=56,n_hM4D=49;High-gamma:P_{trial 12,20,24}<0.05,P_{trial 16}<0.01,n_mCherry=56,n_hM4D=49),提示Hcrt可能通过影响MEC浅层的gamma振荡调控空间探索行为。光遗传学激活MEC浅层内源性Hcrt增强空间探索行为。我们在小鼠LH区注射AAV-EF1α-DIO-ChR2-mCherry,并在MEC浅层埋置光纤实现光遗传学激活MEC浅层内源性Hcrt的释放。在空间探索任务中,光照显著缩短小鼠在空间探索实验早期寻找食物的潜伏期(与对照组比较,Block 1:P_{mCherry×ChR2}<0.001,n_mCherry=6,n_ChR2=5),表明在行为学水平增强了空间探索能力。（2）MEC浅层内源性Hcrt参与调控空间工作记忆化学遗传学抑制MEC浅层内源性Hcrt损害空间工作记忆。在MEC浅层注射CNO抑制内源性Hcrt显著降低了小鼠在正常和干扰性T-迷宫任务中的正确率(正常T-迷宫:hM4D组:P_saline×CNO<0.05,n_saline=6,n _CNO=6;干扰性T-迷宫:hM4D组:P_saline×CNO<0.05,n_saline=6,n _CNO=6),提示空间工作记忆受损。在空间工作记忆任务的执行期光遗传学激活MEC浅层内源性Hcrt强化行为学表现。我们分别在T-迷宫任务的sample trial、delay period和execution trial行光刺激激活MEC浅层内源性Hcrt,观察小鼠行为学变化。结果表明,在正常T-迷宫任务中,不管是在sample trial、delay period还是execution trial光激活MEC浅层内源性Hcrt均不影响小鼠的正确率(n_ChR2=7,n_mCherry=4)。然而,在干扰性T-迷宫任务的execution trial激活内源性Hcrt使小鼠的正确率在原有基础上进一步提高(P_{light off×execution}<0.05,n _ChR2=7,n_mCherry=4),而在sample trial或delay period进行光照则对正确率无明显影响(n_ChR2=7,n_mCherry=4),表明LH_Hcrt-MEC通路在空间学习记忆任务中抵制空间干扰信息也发挥重要作用。研究结论:LH区Hcrt神经元向MEC浅层发出直接纤维投射。Hcrt通过作用于中间神经元突触前兴奋性神经末梢上的HcrtR1,促进谷氨酸释放,增强兴奋性-抑制性神经元突触传递并形成反馈抑制,发挥调控MEC浅层兴奋性-抑制性神经元环路的作用。以调节神经元环路活动为基础,Hcrt增强了MEC浅层局部gamma振荡的能量,最终参与空间学习记忆过程。我们的结果为深入理解Hcrt能系统调控MEC浅层神经元活动、网络振荡及空间学习记忆的作用和机制以及研究觉醒系统参与调控学习记忆功能脑区的工作模式提供了新的可靠证据。