背景:与直接作用于癌细胞的传统化学疗法不同,免疫疗法利用病人自身的免疫系统来消灭肿瘤,已成为当今流行的癌症治疗方式。针对程序性细胞死亡受体1（programmed cell death-1,PD-1）及其配体程序性细胞死亡配体1（programmed cell death-ligand 1,PD-L1）的免疫检查点阻断疗法,已经为黑色素瘤、非小细胞肺癌、晚期肾细胞癌、肝癌等多种癌症提供了临床效益。目前,阿特丽珠单抗、阿维鲁单抗和德瓦鲁单抗等PD-L1抗体已在临床中展现了良好的应用前景。通过阻断PD-1/PD-L1信号通路,T细胞可以被重新激活,为抗肿瘤治疗提供了新的策略。尽管基于抗体的免疫疗法可以提供一种特殊的和相对安全的抗癌策略,但PD-L1抗体仍有几个不可避免的缺点,例如响应率低、易导致免疫相关不良事件、组织渗透性差以及生产和管理成本较高等。因此,新的药物形式以及给药方式亟待被开发,以提高免疫治疗效果与安全性,降低治疗成本。基因编辑技术是一种有效且富有前景的基因治疗策略,利用规律间隔成簇短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）技术对基因进行破坏,已经成为PD-L1免疫检查点疗法的有效手段。通过Cas9蛋白对PD-L1基因特定位点的切割能够长效且不可逆地抑制PD-L1的表达。另一种新型基因治疗策略是脱氧核酶的使用,脱氧核酶是一种具有高催化活性和稳定性的单链DNA分子,能特异性地裂解嘌呤-嘧啶所连接的寡核苷酸,催化RNA的降解。脱氧核酶具有合成成本低、稳定性高、可编程性、活性高等优点,能够作为一种潜在的治疗分子,抑制肿瘤相关基因的表达。由于基因编辑所用质粒和脱氧核酶的本质均为DNA,其固有的负电特性决定了其在生物体内的运输能力和稳定性不足、细胞的摄取和生物利用度有限。同时,全身给药也会导致脱靶效应的发生,产生不必要的不良反应。为了解决这些限制,高效且安全的递送系统亟待被开发。聚酰胺-胺（polyamidoamine,PAMAM）树枝状高分子是一种非病毒性的基因递送载体,与传统的病毒载体相比,其安全性更高,更易于制备。PAMAM外层丰富的氨基为其提供了高密度的阳离子电荷,使其能够有效结合和组装核酸分子,保护它们不被核酸酶降解,并通过“质子海绵”效应实现纳米复合物的内涵体逃逸。此外,PAMAM的氨基表面为多功能修饰提供了有利的条件,目前已经开发了多种修饰策略以提高PAMAM转染效率、降低细胞毒性及提高肿瘤靶向性。目的:以树枝状高分子PAMAM为基础,利用不同的修饰策略对其表面进行改性,构建两种具有高效转染效率及低细胞毒性的递送载体,分别实现以PD-L1为靶点的CRISPR/Cas9质粒及脱氧核酶的肿瘤部位递送。通过对两种纳米复合物理化性质、体外功能及体内疗效的研究,初步阐明其在黑色素瘤免疫治疗中的作用及内在机制,以期为免疫治疗新策略的开发提供理论和实验基础。第一部分碱基修饰PAMAM载体介导PD-L1敲除CRISPR/Cas9质粒递送的研究方法:1.以PD-L1基因为靶点,构建并筛选高效PD-L1敲除质粒pX459-sgPD-L1B。2.利用碱基修饰策略对PAMAM分子表面进行改性,制备碱基修饰型PAMAM载体AP-PAMAM,并通过透射电镜、粒径电位测定、凝胶阻滞实验以及MTT实验对其理化性质进行表征。通过荧光显微镜及流式细胞术优化AP-PAMAM及质粒转染比例,利用激光共聚焦显微镜检验AP-PAMAM/pX459-sgPD-L1B纳米粒子入胞及内涵体逃逸能力。3.利用蛋白免疫印迹实验评估转染后细胞PD-L1表达水平,并通过T7EI实验、Sanger测序以及TIDE分析评估AP-PAMAM/pX459-sgPD-L1B纳米粒子的PD-L1基因编辑效率。4.构建黑色素瘤肺转移小鼠模型,尾静脉注射AP-PAMAM/pX459-sgPD-L1B纳米粒子,通过肺部肿瘤生长情况检测、HE染色、Ki-67免疫荧光染色以及TUNEL凋亡分析评价纳米粒子对肿瘤抑制效果;通过免疫组化染色和ELISA实验检测肿瘤组织PD-L1、CD8、颗粒酶B以及免疫相关细胞因子表达水平以探究免疫激活程度;通过小鼠主要脏器HE染色及肝肾相关生化指标检测评价纳米粒子生物相容性。结果:1.成功构建并获得高效PD-L1敲除质粒pX459-sgPD-L1B;2.制备了碱基修饰型PAMAM载体AP-PAMAM,其具有良好的质粒结合及压缩能力,能够与pX459-sgPD-L1B质粒组装形成稳定的纳米颗粒,同时兼具较低的细胞毒性。3.在肿瘤细胞的转染中,由于天然碱基衍生物的引入,调节了载体与DNA分子氢键相互作用,AP-PAMAM体现了高效的转染效率与内涵体逃逸能力;对转染后小鼠黑色素瘤细胞基因组序列的分析表明,AP-PAMAM/pX459-sgPD-L1B纳米粒子成功破坏了肿瘤细胞中PD-L1基因,降低了PD-L1蛋白的表达。4.在动物实验中,AP-PAMAM/pX459-sgPD-L1B纳米粒子体现了良好的抗肿瘤活性,与未修饰PAMAM载体相比,AP-PAMAM载体介导的pX459-sgPD-L1B质粒递送产生了更为明显的肿瘤消退;AP-PAMAM/pX459-sgPD-L1B纳米粒子的治疗降低了肿瘤组织PD-L1表达水平,增加了CD8+T细胞的浸润,促进了CD8+T细胞的增殖活力和杀伤能力,且具有良好的生物相容性。第二部分肿瘤靶向型PAMAM衍生物介导靶向PD-L1脱氧核酶递送的研究方法:1.对PD-L1 mRNA二级结构进行模拟,选择易被攻击靶点进行PD-L1靶向脱氧核酶设计。随后,利用荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法筛选能够高效切割PD-L1的脱氧核酶Dz4。2.利用氟化修饰、聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）分子偶联以及核仁素适配体AS1411表面改性等多种策略构建肿瘤靶向型树枝状高分子衍生物APFP;通过核磁共振氢谱分析、透射电镜表征、粒径电位测定、凝胶阻滞实验、DNase保护实验以及MTT实验对其理化性质进行表征;制备荧光标记APFP/Dz4纳米复合物,检验其入胞能力、溶酶体逃逸能力及肿瘤细胞靶向性。3.利用荧光定量PCR及蛋白免疫印迹实验评价APFP/Dz4复合物转染对B16-F10细胞PD-L1表达的抑制效果。4.在黑色素瘤肺转移小鼠模型中,通过肺部肿瘤生长情况检测、HE染色、Ki-67免疫荧光染色以及TUNEL凋亡分析系统评价APFP/Dz4复合物抗肿瘤效果;通过免疫组织化学染色分析、流式细胞术以及ELISA等实验对肿瘤部位PD-L1表达、CD8+T细胞的浸润及相关指标进行检测,进一步探究APFP/Dz4复合物激活免疫系统的内在机制;利用小动物活体成像系统追踪APFP/Dz4复合物在荷瘤小鼠体内分布,以评价其肿瘤靶向能力;通过小鼠主要脏器HE染色及肝肾相关生化指标检测评价纳米复合物生物安全性。结果:1.靶向PD-L1的脱氧核酶Dz4具有高效PD-L1 mRNA切割能力,能够在mRNA及蛋白水平上降低PD-L1表达。2.成功制备了肿瘤靶向型树枝状高分子衍生物APFP;APFP载体具有良好的脱氧核酶结合与保护能力,能够与Dz4形成均一且稳定的纳米颗粒,并保护Dz4免受DNase降解;得益于氟化修饰与PEG分子偶联,APFP具有较低的细胞毒性;适配体AS1411的修饰赋予了APFP高度的肿瘤细胞靶向性,使其能够高效将Dz4递送进入肿瘤细胞并实现溶酶体逃逸。3.APFP/Dz4纳米复合物在肿瘤细胞内实现了PD-L1 mRNA的切割,相较于非靶向性载体PFP,APFP/Dz4复合物具有更强的PD-L1表达抑制作用。4.在黑色素瘤肺转移小鼠中,APFP/Dz4复合物显示了良好生物安全性,介导了肿瘤组织的增殖抑制以及凋亡;APFP/Dz4复合物能够高效地增加肿瘤部位CD8+T细胞的募集和激活以及免疫相关细胞因子的分泌;归功于AS1411所介导的肿瘤靶向性,APFP载体介导肿瘤免疫激活效果优于非靶向性载体PFP,并由此实现了更为显著的肿瘤抑制与消退。结论:综上,我们采用不同的修饰策略,设计并构建了两类以树枝状高分子PAMAM衍生物为载体的PD-L1免疫检查点抑制体系,实现了PD-L1敲除质粒及脱氧核酶分子的高效、稳定递送,恢复了免疫系统对于黑色素瘤的识别与杀伤,达到了良好的肿瘤抑制效果。这两种肿瘤免疫治疗平台的开发,为后续PD-L1免疫检查点疗法的研究与开发奠定了良好的基础,有望为免疫治疗的临床应用提供新的策略。