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目的:探讨雷帕霉素对TGF-β1诱导分化的人CD4+CD25+Treg细胞表型及功能的影响,寻找调节免疫系统紊乱以治疗相关疾病的新方法。
方法:使用免疫磁珠分选方法从正常健康人外周血中分离CD4+CD25-T细胞(纯度＞85％)和CD4+CD25+Treg细胞(纯度＞95％)。将CD4+CD25-T细胞分为TGF-β1组(不加Rapa),对照组、TGF-β1+Rapa组,在培养第5d添加不同浓度Rapa(梯度为10ng/ml、50ng/mL、100ng/ml、200ng/ml)至后两组,第7d向三组中添加100ng/ml IL-2。在培养的第5、7、10、14和21d,分别用流式检测细胞中iTreg细胞比例,MTT法检测iTreg细胞抑制功能及ELISA法测定细胞培养上清液中IL-4、IL-10的浓度。
结果:本实验条件下,①100ng/ml为Rapa的最佳刺激浓度,对TGF-β1诱导的CD4+CD25+iTreg细胞的增殖作用最为显著,作用呈时间依赖关系,刺激培养时间越长,CD4+CD25+iTreg细胞比例越高,刺激培养21d细胞扩增效果最明显。经过5d、7d、10d、14d和21d刺激培养后,流式检测TGF-β1组和TGF-β1+Rapa组中CD4+CD25+iTreg细胞比例分别为[(24.57±0.85)％,(27.47±1.06)％,(30.09±2.86)％,(34.02±1.63)％,(32.50±0.81)％]和[(24.57±0.85)％,(40.87±1.35)％,(50.52±1.18)％,(62.60±2.00)％,(82.31±1.56)％],与对照组[(4.36±0.07)％(4.49±0.12)％,(5.36±0.13)％,(5.68±0.18)％,(5.88±0.07)％]相比均明显升高而前两组相比,TGF-β1+Rapa组iTreg细胞百分比明显高于TGF-β1组,差异具有统计学意义(Ps＜0.05,Ps＜0.05);②培养第21d,MTT法分别检测TGF-β1和TGF-β1+Rapa组iTreg细胞的抑制增殖能力,测得OD值[(0.37±0.08)和(0.20±0.06)]与对照组(0.53±0.10)相比降低(Ps＜0.05),且TGF-β1+Rapa组OD值也低于TGF-β组,差异具有统计学意义(Ps＜0.05);③在培养第21d,TGF-β1和TGF-β1+Rapa两组细胞上清液中IL-10[(202.30±7.56)pg/ml和(420.17±13.74)pg/ml]水平均增高,而IL-4[(44.62±1.21)pg/ml和(15.21±1.14)pg/ml]水平均降低,与对照组[(87.15±3.58)pg/ml和(88.48±1.58)pg/ml]相比差异有统计学意义(Ps＜0.05)。
结论:本实验条件下①Rapa可扩增TGF-β1诱导生成的Treg细胞,维持表型稳定长达三周,但不能诱导CD4+CD25-T细胞转化为iTreg细胞;②Rapa扩增的TGF-β1诱导的iTreg细胞具有免疫抑制功能,其功能除了通过细胞间直接接触抑制外,还可能与IL-10分泌增加,IL-4分泌减少有关。