涎腺基因治疗及基因疗法有潜在的治疗涎腺疾病、口腔及全身疾病的应用前景。本课题组已进行了小型猪正常腮腺腺病毒介导的基因转导研究，利用小型猪建立腮腺放射损伤的动物模型及腺病毒介导的水通道基因治疗放射损伤，有明显增加腮腺唾液流率的作用，但疗效仅1-2周，其临床应用有限。如何有效持续长期表达转导基因是涎腺基因治疗所面临的主要技术难点之一。腺病毒相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)是对人类无致病性，免疫原性低，可转导分裂细胞和非分裂细胞，并且能够介导外源基因长期稳定表达等生物学特性。本研究利用AAV介导的外源性基因在体外及小型猪腮腺体表达，观察其表达规律及特点，为进一步应用此载体进行涎腺基因治疗打下基础。 本研究的第一部分内容为重组2型腺病毒相关病毒(Recombinantadeno-associatedvirusserotype2，rAAV2)体外基因转导人胚肾293(humanembryoniccell293，HEK293)细胞与人颌下腺(humansubmandibulargland，HSG)细胞的研究。目的是研究rAAV2介导的β-半乳糖苷酶基因和人红细胞生成素(humanerythropoietin，hEPO)基因HEK293细胞与HSG细胞的体外表达，为进一步的应用AAV进行涎腺基因转导提供实验依据。材料与方法：用感染复数(Multiplicityofinfection，MOI)为105的携带β-半乳糖苷酶基因的腺病毒相关病毒(rAAV2LacZ)转导HEK293细胞和HSG细胞，组织化学方法检测β-半乳糖苷酶基因表达，计数转导效率。用MOI分别为103、104和105的携带hEPO基因的腺病毒相关病毒(rAAV2hEPO)转导HEK293细胞和HSG细胞，ELISA法测定hEPO含量。结果表明：rAAV2介导的β-半乳糖苷酶基因转导HEK293与HSG后组织化学染色显示转导率分别为68.2％和66.3％。rAAV2介导的hEPO基因转导HEK293细胞与HSG细胞后，随MOI值增加和时间的延长，hEPO的浓度增高。MOI=105，转导后72h时，HEK293细胞培养基中的hEPO浓度达到482.54mIU/ml，HSG细胞培养基中的hEPO浓度为458.22mIU/ml。因此，rAAV2载体在体外可以有效转导涎腺细胞，可以进一步应用于动物体内实验。 本研究的第二部分内容为小型猪腮腺和颌下腺中的AAV载体受体表达研究。目的是通过免疫组化的方法，对小型猪腮腺和颌下腺细胞中是否表达硫酸乙酰肝素糖蛋白(heparinsulfateproteoglycan，HSPG)和PDGF(plateletderivedgrowthfactorreceptorα，PDGFR-α)受体α的研究，为进一步利用AAV介导的小型猪涎腺基因转导研究提供依据。材料和方法：应用兔抗人HSPG单抗，兔抗人PDGFR-α多抗，采用免疫组化方法，检测小型猪腮腺和颌下腺中的HSPG和PDGFR-α表达。结果表明：腮腺的腺泡、导管和间质中HSPG和PDGFR-α都有较强的表达。腮腺中HSPG在间质中的表达强于导管和腺泡。而PDGFR-α在腮腺腺泡、导管和间质中都有较强的表达，表达强度相近。颌下腺导管和间质中有HSPG的表达，腺泡中无表达。导管和间质之间的表达无显著性差异。同样颌下腺导管和间质中有PDGFR-α的表达，腺泡中无表达。导管和间质之间的表达无显著性差异。本研究表明为小型猪腮腺和颌下腺中有AAV载体的受体，为进一步进行小型猪涎腺AAV介导的基因治疗提供了理论依据。 本研究第三部分内容为rAAV2介导的hEPO基因转导小型猪腮腺研究。目的是了解rAAV2介导hEPO基因在小型猪腮腺内的表达情况，进而了解小型猪基因转导的最佳剂量和表达时间曲线和表达规律，以及腺体的病理学改变。材料和方法：14只实验用小型猪，分别单侧腮腺投递109v.g、1010v.g、和1011v.g滴度的携带hEPO基因的rAAV2载体。动物基因转导前1周和转导后每隔两周测量腮腺唾液hEPO、血清hEPO、唾液流率和生化检查、血常规和血液生化检测。转导后6周和16周时进行腮腺病理学检查。结果表明：①所有动物的转导前的唾液中没有检测到hEPO。1011v.g滴度的AAV2hEPO转到组转导后2周时唾液中可以检测到较高浓度的hEPO42.54±14.31mIU/ml，此后浓度迅速增加，8周时平均达到129.52±29.42mIU/ml。此后转导侧唾液中的hEPO浓度一直保持到较高水平，一直到转导后32周时hEPO浓度仍保持在78.69±47.69mIU/ml。非转导侧腮腺液中未检测到hEPO。而109v.g和1010v.g剂量组转导侧腮腺液中的hEPO浓度也逐渐提高，8周时转导侧腮腺液中hEPO浓度分别达到5.4±1.43mIU/ml和16±6.93mIU/ml，到16周时hEPO浓度维持到相同的水平，分别为3.4±0.57mIU/ml和13.5±4.22mIU/ml。未转导侧腮腺唾液中和对照载体转导组中腮腺唾液中均没有检测到hEPO。②所有动物的转导前血清中没有检测到hEPO。1011v.gAAV2hEPO转导组血清hEPO水平在4周内逐渐增加5.8mIU/ml，维持到10周后，其后hEPO浓度下降，16周时血清中基本检测不到hEPO。其余两个低剂量组和对照载体组的血清中的没有检测到hEPO。③血常规分析HCT和HGB在转导前分别为39.75±2.33％、123±1.41g/L。转导后6周时分别升高至44.05±2.89％、138±4.94g/L。转导后16周时分别为44.41±2.58％和149±3.55g/L。统计学分析，HCT和HGB转导后6周和16周时高于转导前的水平，有显著性差异(P＜0.05)。其余各项指标无显著性差异。④所检测的血液生化检查的项目中小型猪腮腺腺病毒转导前和转导后6周、16周各项指标经统计学检验，无显著性差异。⑤小型猪转导前唾液流率转导前和转导后6周和16周时的唾液流率分别为3304±606ul/ml、3393±532ul/ml和3463±571ul/ml。转导前和转导后6周和16周的唾液流率与对照组的唾液流率比较，无显著性差异。⑥1011v.gAAV2hEPO转导组转导后6周和16周腮腺标本组织学检查中未发现明显的炎症细胞浸润和涎腺组织结构改变。 本研究表明腺病毒相关病毒介导的外源基因体外转导HEK293和HSG细胞有明显表达，首次证实小型猪涎腺中表达AAV2和AAV5受体。在此研究的基础上，首次进行了小型猪腮腺腺病毒相关病毒介导的基因转导研究，得到了小型猪腮腺基因转导的最佳条件和基因表达时间曲线和规律，为进一步的利用小型猪进行腺病毒相关病毒介导的涎腺基因转导提供的实验基础。