肿瘤的生长具有血管依赖性,需要血管提供充足的氧气和营养,这也使得抗肿瘤血管生成治疗成为治疗恶性肿瘤的一个颇具前景的手段。抗肿瘤血管治疗在最初阶段被认为可以抑制肿瘤血管形成、阻断肿瘤的营养和氧气的供应,进而使得肿瘤缺血、缺氧从而抑制肿瘤生长。但是在临床单独应用抗血管治疗并不能取得明显疗效,而将抗血管治疗与化疗或放疗联合应用,却可以明显提高临床疗效。目前,肿瘤过继性细胞免疫治疗是肿瘤生物治疗的热点领域。过继性细胞免疫治疗在体外实验中表现出明显的抗肿瘤活性,给肿瘤免疫治疗带来了新的希望,但是单独的过继性细胞免疫治疗不能使肿瘤患者的生存期明显延长。而过继性细胞免疫治疗面临的主要挑战是过继性免疫细胞向肿瘤组织归巢和肿瘤内部免疫抑制性的微环境。由于肿瘤血管在结构及功能上的异常,肿瘤组织中出现乏氧区域,并形成免疫抑制性的肿瘤微环境。肿瘤血管的完整性和肿瘤免疫抑制的微环境在很大程度上影响着过继性细胞免疫治疗的疗效。而抗血管治疗对这两个方面都有调节作用。本研究旨在观察联合抗血管治疗与细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells,CIK cells)过继性免疫治疗在小鼠肿瘤模型(A549肺癌、SPC-A1肺癌和Lewis肺癌)中的协同抗肿瘤作用,同时,本实验观察了抗血管治疗对肿瘤微血管结构和功能的调节、对肿瘤乏氧微环境的改善以及肿瘤免疫微环境对CIK细胞的影响。体外乏氧模型的建立使得我们得以观察乏氧对CIK细胞的增殖、杀伤、迁移以及黏附能力的影响。研究表明,将抗血管治疗与过继性CIK细胞免疫治疗联合可以起到协同抗肿瘤作用,为肿瘤治疗提供了新策略。第一章重组人血管内皮抑素增强CIK细胞对非小细胞肺癌的抑制作用及其机制研究[目的]本研究旨在观察重组人血管内皮抑素(rh-endostatin)在小鼠模型(Lewis肺癌、A549肺癌、SPC-A1肺癌)中对细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkiller cells,CIK cells)的抗肿瘤活性的增强作用,并从肿瘤血管微环境及乏氧微环境的调节两个方面阐述抗血管治疗的增效作用。[材料与方法]1.分别建立BALB/cnu/nu裸鼠A549、SPC-A1肺癌模型和C57BL/6小鼠Lewis肺癌模型,荷瘤小鼠分别随机分为四组:NS组(给予生理盐水)、EN组(给予rh-endostatin)、CIK组(NS处理7天后给予CIK细胞)、EN+CIK组(rh-endostatin处理7天后联合CIK细胞)。隔日测量肿瘤长短径、监测肿瘤体积,观察各组治疗方案对肿瘤生长的抑制作用。2.流式细胞术观察体外培养7天、14天、21天的CIK细胞中CD3+CD56+细胞的百分比。3.分离rh-endostatin和NS处理后的A549肺癌模型中的肿瘤组织,分别行CD31、α-SMA分子免疫荧光染色以评估肿瘤微血管密度及肿瘤血管周细胞覆盖率。4.通过尾静脉注射Evans Blue,利用活体血管成像显示肿瘤血管对大分子物质的通透性,动态对比增强磁共振(DCE-MRI)观察分析Ktrans在rh-endostatin治疗前后的变化,研究th-endostatin处理后肿瘤血管对小分子物质通透性的改变。5.将CFSE标记CIK细胞回输rh-endostatin或NS处理7天的小鼠,流式细胞术观察各组小鼠肿瘤组织或者脾脏中浸润的CIK细胞的比例。6.流式细胞术观察th-endostatin处理7天后荷瘤鼠肿瘤以及脾脏中骨髓来源抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)、肿瘤相关巨噬细胞(Tumor associated macrophages,TAMs)的变化。7.乏氧探针检测肿瘤内部的乏氧状况,小鼠连续7天予以rh-endostatin处理,在第3天、第6天及第9天处死小鼠,处死小鼠前4小时腹腔注射乏氧探针,免疫组化显示肿瘤内部的乏氧区域,观察rh-endo statin处理对肿瘤乏氧的影响。[结果]1.在三种小鼠肺癌模型中,rh-endostatin联合CIK细胞过继性免疫治疗可以明显抑制肺癌的生长,起到协同抗肿瘤作用;而单独rh-endostatin治疗或单独CIK免疫治疗对肺癌生长无明显抑制作用。2.流式细胞术观察体外培养7天、14天、21天的CIK细胞中CD3+CD56+细胞的百分比。在第7天、14天、21天,CD3+CD56+细胞的百分比分别为8.93%,23.66%and 17.17%。3.Rh-endostatin可以降低肿瘤的微血管密度、增加周细胞覆盖率进而促进肿瘤血管正常化。4.Rh-endostatin可以减少肿瘤血管对大分子物质(Evans blue-Albumin,67kD)的渗透性,增加对小分子物质(Gd-DTPA,0.55kD)的渗透性。5.Rh-endostatin可以增加CIK细胞向肿瘤组织以及脾脏的浸润。CIK细胞在Rh-endostatin组肿瘤组织中的比例高于对照组(15.95±1.64%vs 1.57±0.07%,P=0.006),CIK细胞在rh-endostatin处理组小鼠脾脏组织中的比例也高于对照组(5.55±1.56%vs 1.63±0.22%,P=0.036)。6.Rh-endostatin处理可以下调肿瘤局灶中MDSCs的比例(3.21±0.19%vs 4.62土0.43%,P=0.022)而不影响脾脏组织中MDSCs的比例(7.65±1.65%vs 7.82土1.51%,P=0.394)。Rh-endostatin处理对肿瘤局灶中以及脾脏组织中TAMs的比例均无影响。7.Rh-endostatin可以减少肿瘤内部乏氧面积。A549肺癌模型中,rh-endostatin处理后第6、9天,肿瘤乏氧面积较对照组明显减少(P值分别为P=0.002和P=0.0093)。[结论]在多种小鼠肺癌模型中,rh-endostatin与过继性CIK细胞免疫治疗联合可以起到协同抗肿瘤作用。这与抗血管治疗促进肿瘤血管正常化、改善肿瘤乏氧微环境和免疫抑制性微环境、促进CIK细胞向肿瘤组织归巢相关。第二章紫杉醇节律化疗增强CIK细胞对非小细胞肺癌的抑制作用[目的]本研究旨在利用紫杉醇(paclitaxel,PTX)节律化疗的抗血管生成作用,将其与CIK细胞过继性免疫治疗结合,探索联合治疗对非小细胞肺癌的协同抗肿瘤作用及其机制研究。[材料与方法]1.分别建立BALB/c nu/nu裸鼠A549肺癌模型和BALB/c nu/nu裸鼠PTX耐药的A549肺癌模型,随机分为四组:NS组(给予NS)、CIK组(给予CIK细胞)、PTX组(给予PTX节律化疗)、PTX+CIK组(给予PTX节律化疗后联合CIK细胞)。隔日测量肿瘤长短径、监测肿瘤体积,观察各组治疗方案对A549肺癌以及PTX耐药的A549肺癌的抑制作用。2.观察小鼠的外观、活动能力、反应能力和体重,利用临床外观评分系统进行评分,以评估各组小鼠的健康状态。3.PTX节律化疗处理A549荷瘤小鼠5天后,乏氧探针检测PTX节律化疗对肿瘤乏氧状况的影响。4.将A549肿瘤组织行连续切片,分别行乏氧检测及CD3+CIK细胞染色,研究乏氧与CIK细胞浸润的关系5.分离PTX节律化疗或NS处理后的A549肺癌模型中的肿瘤组织,行CD3分子免疫组化染色以评估肿瘤组织局灶T淋巴细胞在各处理组的浸润情况。[结果]1.在BALB/c nu/nu裸鼠A549肺癌模型及BALB/c nu/nu裸鼠PTX耐药的A549肺癌模型中,PTX节律化疗联合CIK细胞过继性免疫治疗均可以明显抑制肺癌的生长;单独PTX治疗及单独CIK免疫治疗不能抑制肺癌的生长,联合治疗起到协同抗肿瘤作用。2.对照组、PTX或CIK细胞单药治疗组的小鼠体重比实验开始时明显下降。然而,联合治疗组小鼠体重在实验结束时无明显变化。联合治疗后小鼠的整体健康评分优于单药治疗组和生理盐水对照组(所有P值均<0.05)。3.A549肺癌模型中,PTX节律化疗处理5天诱导肿瘤内部乏氧面积较对照组明显降低(12.74±0.72%vs 38.05±3.98%,P=0.003)。4.乏氧区域CIK细胞浸润极少,而非乏氧区域CIK细胞浸润明显高于乏氧区域,说明乏氧可以抑制CIK细胞的浸润。5.A549肺癌模型中PTX节律化疗可以促进过继性输注的CIK细胞至肿瘤局灶的归巢。[结论]PTX节律化疗可以减少肿瘤乏氧面积。与过继性CIK细胞免疫治疗联合可以增加后者的疗效,促进CIK细胞向肿瘤组织局部浸润,起到协同抗肿瘤作用。联合节律化疗与过继性免疫治疗可以改善荷瘤小鼠的健康状态。第三章乏氧对CIK细胞及血管内皮细胞的影响[目的]本研究旨在建立体外乏氧模型,研究乏氧对CIK细胞增殖、迁移、细胞毒性及黏附能力的影响。[材料与方法]1.将CIK细胞分别置于乏氧培养及正常氧含量培养条件下48小时,而后在光学显微镜下计数CIK细胞的数目,计算不同培养条件下CIK细胞的增殖能力。2.免疫细胞化学方法观察在乏氧及正常氧含量培养条件下,CIK细胞对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的黏附能力。3.免疫细胞化学观察乏氧和正常氧含量培养条件下HUVECs表达细胞间黏附分子-1(intercellar adhension molecular-l,ICAM-l)和血管内皮黏附分子-1(vascular cell adhension molecular-1,VC AM-1)的能力。4.Transwell实验研究CIK细胞穿透HUVECs细胞层的迁移能力。5.LDH释放实验研究乏氧及正常氧含量条件下,不同效靶比时CIK细胞对A549肿瘤细胞的杀伤作用。6.免疫组织化学观察在肿瘤组织内ICAM-1和VCAM-1的表达与CIK细胞浸润的关系。[结果]1.正常氧含量条件下,CIK细胞形成较多较大的生长集落;而乏氧条件下CIK细胞只能形成较少量、较小的集落。CIK细胞在正常条件下增殖速度明显高于乏氧条件下,乏氧可以抑制CIK细胞的增殖。2.在乏氧条件下培养的CIK细胞对HUVECs的黏附能力能力明显低于正常氧含量条件下的增殖速度。乏氧可以抑制CIK细胞的增殖。3.相比于正常氧含量培养条件,乏氧明显抑制HUVECs表达黏附分子ICAM-1、VCAM-1。4.在正常氧含量的培养条件下,CIK细胞穿透HUVECs单细胞层的数目是乏氧条件下的2.89倍(P=0.003),乏氧培养下CIK细胞的迁移能力明显降低。5.在正常氧含量培养条件下,效靶比为20:1和40:1时,CIK细胞对A549肺癌细胞杀伤率分别为49.09±2.54%和77.06±12.48%;而乏氧培养时,CIK细胞的杀伤率仅为8.35±2.74%和30.76±6.19%。6.在肿瘤组织中ICAM-1或VCAM-1高表达的区域,CD3+CIK细胞的浸润也增多;而在ICAM-1或VCAM-1低表达的区域,CD3+CIK细胞的浸润明显减少。[结论]乏氧可以抑制CIK细胞的增殖,降低CIK细胞对HUVECs的黏附能力及穿越HUVECs细胞层的迁移能力,减低CIK细胞对A549肺癌细胞的杀伤能力。乏氧还可以降低HUVECs表达内皮细胞黏附分子ICAM-1和VCAM-1,后两者在肿瘤组织内部与CIK细胞的浸润呈正相关。第四章 VEGFR2酪氨酸磷酸化位点Y951/Y949在肿瘤血管形成中的影响[目的]研究VEGFR2信号通路上酪氨酸磷酸化位点Y951/Y949在血管形成中的作用,以及其在肿瘤生长、转移中起到的作用。[材料与方法]1.用胚胎干细胞体外培养形成胚胎小体,研究Y949在血管形成中的作用。2.Mile实验在小鼠体内进行,研究Y949突变对血管通透性的影响。3.RipTag野生型小鼠和RipTag Y949突变型小鼠,当小鼠约12-14周龄时,处死小鼠,快速分离胰腺肿瘤组织,测量肿瘤的大小并计算肿瘤体积。4.免疫荧光检测肿瘤组织中Fibrinogen、NG2、podocalyxin的表达[结果]1.VEGFR2酪氨酸磷酸化位点Y949突变导致胚胎小体(EB)形成障碍,抑制血管形成2.VEGFR2酪氨酸磷酸化位点Y949突变导致血管对伊凡氏蓝的渗透性降低,改善血管功能3.VEGFR2酪氨酸磷酸化位点Y949突变的RipTag小鼠胰腺肿瘤生长被抑制4.VEGFR2酪氨酸磷酸化位点Y949突变不影响Fibrinogen的表达5.VEGFR2酪氨酸磷酸化位点Y949突变小鼠肿瘤中NG2/CD31表达下降6.VEGFR2酪氨酸磷酸化位点Y949突变小鼠肿瘤中podocalyxin表达下降7.Y949突变抑制RipTag肿瘤的肝转移[结论]VEGFR2信号通路上酪氨酸磷酸化位点Y951/Y949突变具有抑制血管形成、降低血管通透性、抑制肿瘤生长和转移。并且Y951/Y949突变抑制podocalyxin表达。