甜菊(Stevia rebaudiana Bertoni)又名甜叶菊,为菊科(Asteraceae)甜菊属(Stevia)宿根性多年生草本植物,因其叶片所含甜菊糖苷具有高甜度(蔗糖的250～400倍)、低热量(蔗糖的1/300)的特点及预防和辅助治疗糖尿病、高血压等药用价值而备受关注。甜菊糖苷是以甜菊醇为苷元的多种四环二萜类糖苷的统称,甜菊醇的C19和C13位上连接的糖基数目和种类不同导致各甜菊糖苷组分特性和功能的差异。甜菊糖苷中的主要成分甜菊苷(Stevioside,St)和莱鲍迪苷A(Rebaudioside A,RA)占总糖苷含量的60%～80%,而糖苷的总含量决定了干叶原料的品质。RA苷在甜度上约为蔗糖的450倍,甜度与蔗糖味质更接近。St苷在甜度上约为蔗糖的250～300倍,味质略苦。在上述两种糖苷的结构上,RA苷比St苷的C-13位C3’多一个葡糖基,两者之间可以通过糖基化和去糖基化相互转化。而β-葡萄糖苷酶是重要糖苷水解酶可能参与两者的相互转化。本文以甜菊品种‘中山5号’为主要研究材料,通过离子交换色谱和凝胶过滤色谱的方法纯化β-葡萄糖苷酶,并对其理化性质和甜菊中该酶活性差异进行了研究。主要研究内容如下:1、以甜菊品种‘中山5号’现蕾期的叶片为材料,分离纯化β-葡萄糖苷酶。首先通过硫酸铵分级沉淀的方法对酶蛋白进行粗提,并优化提取条件。再经透析脱盐、离子交换色谱和凝胶过滤色谱的方法进一步纯化甜菊β-葡萄糖苷酶。结果表明,逐步加入硫酸铵直至饱和度为40%时的酶活性较高。提取液为磷酸缓冲液pH为7.0时的酶活性较高。反应体系在37℃反应1h时的酶活性相对较高。将酶液充分的透析脱盐,并用阴离子交换剂DEAE-52和Sephadex G-200葡聚糖凝胶对该酶进一步纯化。经纯化后甜菊β-葡萄糖苷酶的分子量约为55KD,纯化倍数为10.22倍。2、分析温度、pH、金属离子和抑制剂对甜菊β-葡萄糖苷酶活性的影响,以及该酶的热稳定性、pH稳定性和保存稳定性。结果表明,在20℃～40℃的温度范围内酶活性相对较高,之后随温度升高酶活性逐渐下降。将反应液分别置于冰浴、30℃、40℃、50℃和60℃,每个温度梯度处理30、60、90、150和180min。测定反应液的酶活性,发现酶活性呈逐渐下降趋势。用不同pH的提取液提取甜菊β-葡萄糖苷酶,当提取液pH为7.0时酶活性相对较高。将不同pH的酶液于4℃保存24h后测定其pH稳定性,酶活性在pH为6.0～8.0时相对较稳定。在反应体系中加入Mn2+、Fe2+和SDS,所测得酶活性均大于对照,可见其对酶活性有促进作用;而Hg2+、Cu2+和CO2+对酶活性有抑制作用。将酶液于4℃条件下保存,在28天间测定其酶活性变化,结果显示,酶活性随着时间的推移逐渐降低。3、分别纯化了甜菊植株不同器官、不同生育时期和不同品种的β-葡萄糖苷酶并分析其活性。以甜菊‘中山5号’开花期植株的根、茎、叶、花为材料测定其酶活性,结果显示叶片中的酶活性相对较高。以不同生育时期的‘中山5号’叶片为材料分析其酶活性,结果显示,开花期的酶活性相对较高,其酶活性依次为开花期>现蕾期>快速生长期。以供试甜菊品种‘中山5号’、‘中山6号’、‘中山8号’、‘华晶’、‘江甜2号’、‘守田3号’现蕾期的叶片为材料分析其酶活性。结果显示,华晶的酶活性相对较大,其酶活性依次‘华晶’>‘中山5号’>‘中山8号’>‘中山6号’>‘守田3号’>‘江甜2号’。