肝脏是分泌产生IGF1的主要场所。大量研究发现,类胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor 1,IGF1)与其受体(IGF1R)以及相关结合蛋白(IGFBPs 1-6)组成的系统对动物的生长发育及代谢具有关键的调控作用。本项目组前期选择了出生前三个时期(妊娠50日胎龄、妊娠70日胎龄及妊娠90日胎龄)及出生后5个时期(出生当天、20日龄、70日龄、120日龄、180日龄)猪肝脏组织为试验材料,对IGF1在出生前后猪的肝脏中的表达模式进行了检测,研究结果显示,IGF1出生前的表达水平相对较低,出生后的表达量即出现了显著性的增加。尽管如此,IGF1在出生前后表达量的显著性变化是发生在妊娠90日龄至出生当天这段时间中的某一个节点,以及造成IGF1出生前后表达模式差异的分子调控机制仍不清楚。因此,本试验新增了妊娠110日龄阶段的猪肝脏组织,完善了IGF1在妊娠90日龄至出生当天的表达模式,并初步研究了 IGF1出生前后表达差异的分子调控机制。作为哺乳动物体内最大的内脏器官之一,肝脏表现出分泌多种激素的内分泌及外分泌的特质,在多种代谢的过程中发挥重要的作用。肝脏可合成分泌载脂蛋白及脂蛋白、脂代谢酶,表达脂蛋白受体摄取脂质等方式,维持机体的脂肪平衡状态,是研究机体脂代谢的合适靶器官。然后,妊娠时期及出生后的肝脏在脂代谢功能中所发挥的作用存在明显的差异,目前对不同动物的肝脏组织microRNA(miRNA)及mRNA的表达差异及功能鉴定已经有部分研究报道,但针对猪出生前后不同发育期肝脏组织差异表达的miRNA、mRNA,以及其所参与的生物学过程及通路的研究却鲜见报道。MiRNA是一种长约22bp的非编码RNA,通过表观遗传调控的方式参与了生物体一系列的生物学过程,包括细胞生长、细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、糖代谢、脂肪成与分解及蛋白质的合成与分解等,因而受到了诸多科研工作者的关注。转录组高通量测序能够针对某一特定时期的某一特定组织或者是细胞挖掘出所有的基因及miRNA,对二者的整合分析可以准确的、深入的鉴定出影响猪肝脏组织发育相关及参与脂代谢的关键miRNA及基因,可以帮助我们更全面的了解肝脏发育及脂代谢等调控的分子机理。因此,本研究以大白猪妊娠70日龄及出生后70日龄猪的肝脏组织为试验材料,每个时期选取4个个体,共计8个样本进行了如下内容的研究:(1)通过RNA-Seq技术,对大白猪出生前后两个时期的肝脏组织进行高通量测序,通过数据分析鉴定出出生前后肝脏组织中差异表达的miRNA和mRNA,并对两个转录组的数据进行联合分析。所获得的研究结果为进一步了解miRNA对肝脏组织发育及脂代谢的调控提供坚实有力的理论基础;(2)研究了转录因子C/EBPβ影响IGF1表达的转录调控机制;(3)研究C/EBPβ在猪肝脏中的表达规律及其表达的调控,并探讨其出生前后表达水平显著性变化的机制;(4)从表观调控的角度,探讨IGF1启动子区甲基化差异对其表达的影响;(5)根据miRNA及mRNA测序结果、从表观调控的角度探究了潜在调控IGF1表达的miRNA。根据以上研究内容所获得的研究结果如下:1.大白猪妊娘70日龄胎猪(P70)及70日龄仔猪(D70)肝脏组织miRNA测序分析本研究共构建了 8个miRNA文库(每个发育期分别建立了 4个肝脏样本测序文库),平均获得约28M(百万)的raw reads。去掉无效数据后,分别获得约20M(百万)、可用于后续分析的clean reads。长度统计分析显示,肝脏组织的miRNA主要分布在21-23nt范围内,符合miRNA的长度分布特点。进一步,对所获得的miRNA进行表达差异分析、聚类分析、GO富集分析以及KEGG通路富集分析。差异表达分析的结果显示:本试验gong共鉴定了 116个差异表达的miRNA,较70日龄仔猪(D70)而言,61个是表达上调的,55个是表达下调的。而聚类分析的结果显示,同一生长发育期的4个样本可以很好的聚到一起,说明样本的整齐度较高,后续进行的一系列生物信息学分析更加可靠。另外,GO功能注释及KEGG通路富集分析发现,主要富集的GO条目有细胞分化过程、发育过程、代谢过程、信号传导过程及生物学调节等条目;主要富集的KEGG条目有cAMP信号通路、Wnt信号通路、Notch信号通路、PI3K-Akt、MAPK信号通路、FoxO信号通路、脂肪细胞因子信号通路、甲状腺激素信号通路等。这些通路对动物肝脏的发育及脂代谢的过程具有重要的作用。在此基础上,随机挑选10个差异表达的的miRNA进行qRT-PCR验证,结果表明,荧光定量结果同高通量测序获得的结果一致,表明测序结果真实可靠。2.大白猪妊娘70日龄胎猪(P70)及70日龄仔猪(D70)肝脏组织mRNA测序分析本研究gong共构建了 8个mRNA文库(每个发育阶段分别选取4个肝脏样本),测序分析共鉴定了25323个已知的基因、9986个新的转录本。差异表达分析显示,两个不同发育期共存在4916个差异表达的mRNA,较70日龄仔猪(D70)而言,2502个基因是表达上调的,2414个基因是表达下调的。其中126个基因仅在P70样本中表达,75个基因仅在D70样本中表达,4715个基因在两个生长期的样本中均有表达。对差异表达的miRNA进行层次聚类分析,结果显示同一生长发育的4个样本可以很好的聚到一起,说明统一阶段重复样本的整齐度较高。进一步,对差异表达的mRNA进行GO功能注释及KEGG通路富集分析发现,分析结果显示,主要富集的GO条目包括代谢、应激和免疫反应等;KEGG条目包括DNA复制、细胞周期、脂肪酸代谢、糖代谢、药物代谢、氨基酸降解、PPAR信号通路、类固醇激素合成等过程。随机挑选10个差异表达的的mRNA进行qRT-PCR验证,结果显示,荧光定量结果同高通量测序所获的的结果一致,说明了本次测序结果真实可靠。3.MiRNA及mRNA测序结果的整合分析在高通量转录组测序基础上,本研究使用miRanda及TargetScan等软件对差异显著上调的的miRNA进行靶基因预测,并与mRNA测序中获得的差异显著性下调的基因进行交集分析,以此获得“表达量上调的miRNA-表达量下调的mRNA对”,本研究共获得60对“上调miRNA-下调mRNA”;对差异显著下调的的miRNAs进行靶基因预测,并与mRNA测序中获得的差异显著性上调的基因进行交集分析,以此获得55对“下调miRNA-上调mRNA”。进一步GO及KEGG富集分析结果显示,主要富集的GO条目为血小板生成素受体活性及抗原结合等;主要富集的KEGG条目为TNF及免疫系统等信号通路上。4.双荧光素酶报告系统研究潜在转录因子C/EBPβ对IGF1的表达调控荧光定量PCR结果显示,不同发育期C/EBPβ mRNA水平的表达模式同IGF1 mRNA表达模式相似:出生后的表达量显著的高于出生前的表达量。双荧光素酶报告试验显示,C/EBPβ可以显著性的增加野生型的IGF1启动子区的荧光素酶活性,位点2突变后,荧光酶活性较野生型而言,有了极显著性的下降;位点1突变后,荧光素酶活性有了细微的下降,但差异并不显著;位点1、2同时突变后,其荧光素酶活性较野生型而言有了极显著性的下降。以上结果说明C/EBPβ主要通过作用于IGF1启动子区的位点2处,从而调控IGF1基因的表达。5.猪出生前后肝脏组织IGF1不同型启动子甲基化模式的研究针对大白猪IGF1基因的潜在Ⅰ型及Ⅱ型启动子区序列进行甲基化测序,结果分析显示,大白猪妊娠70日龄(P70)、妊娠110日龄(P110)、出生当天(D0)及出生70日龄(D70)的肝脏组织、共16个样本中,IGF1的两个潜在的启动子区域的甲基化水平并没有显著性的变化,而只是在个别位点存在细微差异,但这种差异并不显著。研究结果表明IGF1在出生前后肝脏中的急剧变化并不是由其启动子区的甲基化差异所导致。6.miR-18b及miR-130b可以直接靶向IGF1的3,-UTR区,从而调控其表达MiRNA及mRNA测序联合分析结果显示,IGF1是miR-1 8b和miR-130b直接靶向基因,且miR-18b和miR-130b与IGF1呈现相反的表达模式。在此基础上,本研究采用qRT-PCR技术对他们的表达模式进行了检测,结果表明,荧光定量结果与测序结果完全一致。进一步,本研究利用双荧光素酶报告系统对它们之间的调控关系进行了验证,结果表明miR-18b及miR-130b可以通过直接靶向IGF1 3’-UTR区抑制IGF1的表达。7.猪出生前后肝脏组织C/EBPβ上游潜在转录因子表达模式研究生物信息学分析显示,C/EBPβ上游调控区域存在多个潜在的转录位子结合位点,因此本研究利用荧光定量PCR对C/EBPβ上游潜在转录因子在猪出生前后肝脏组织中的表达模式进行了检测,荧光定量PCR结果显示,不同发育期C/EBPβ的潜在转录因子STAT3,CALR,CUGBP1,Sβl的mRNA水平的表达模式同C/EBPβmRNA表达模式相似,即出生后的表达量显著的高于出生前的表达量;而Myb,RARA及SREBP mRNA水平的表达同C/EBPβmRNA表达模式相反,即出生前的表达量显著的高于出生后。