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第一部分氟西汀对AD转基因小鼠行为学及内侧前额叶皮质体积的作用目的:已有研究表明氟西汀能够改善AD的认知功能,但其机制仍不清楚。内侧前额叶皮质(MPFC)为AD受累的主要脑区之一,多项研究表明在阿尔茨海默病(AD)疾病的早期,一定比例的AD患者存在明显的执行功能障碍,而且AD患者会伴有显著的与执行功能障碍和相关的前额叶皮质萎缩。因此,本研究主要探讨氟西汀对AD转基因小鼠行为学、MPFC体积及其内Aβ蛋白沉积和Tau蛋白磷酸化的作用。1[基金项目]国家自然科学基金(81671259,81871073,81801269),重庆市首届百名学术学科领军人才培养资助经费(2012),the 2016 Supporting Innovation Projects of Graduate Students of Chongqing,and the 2016 Supporting Excellent Ph.D Projects of Chongqing Medical University.方法:选取40只8月龄的雄性APP/PS1双转基因AD小鼠,以及40只8月龄同窝生野生型小鼠。8月龄的AD转基因小鼠被随机分为AD生理盐水组(AD+NS)和AD氟西汀组(AD+FLX),8月龄的同窝生野生型(WT)小鼠则分为野生型生理盐水组(WT+NS)和野生型氟西汀组(WT+FLX)。给予AD+FLX组及WT+FLX组小鼠腹腔注射氟西汀(10mg/kg/d),持续2个月。同时,给予相应月龄AD+NS组及WT+NS组小鼠腹腔注射等剂量的生理盐水。其中每组在氟西汀干预的第5周给予连续7天的BrdU腹腔注射(50mg/kg/d)。每周均检测4组小鼠的体质量。为期2个月的干预后,对各组小鼠进行旷场测试,以检测小鼠的运动能力和焦虑样行为;运用Morris水迷宫测试小鼠的空间学习和记忆能力;运用Y迷宫检测小鼠的执行能力及工作记忆。在结束行为学测试后,每组小鼠各随机地选取6只小鼠,用1%的戊巴比妥麻醉后,经心脏灌注4%多聚甲醛,固定和解剖大脑组织。将每只小鼠大脑分为左右两侧脑半球,置于蔗糖水中进行梯度浓度的脱水,于冰冻切片机中用OCT包埋剂包埋脑组织后从头侧向尾侧切取60μm厚的连续组织切片,对包含有MPFC结构的组织切片进行体视学抽样分数为1/4的等距随机抽样,两侧脑半球可切取8组含有MPFC结构的连续等距切片。随机抽取一组等距切片,进行甲苯胺蓝尼氏染色,在体视学分析软件里运用细胞构筑法定义并勾画MPFC边界,并运用卡瓦列里原理计算出各组小鼠的MPFC体积。余下的冰冻组织切片则经过免疫组织化学染色和免疫荧光双标等方法观察MPFC内Aβ斑块的情况和p-Tau+(ser396)细胞的情况。并且在行为学测试后,每组小鼠各随机选取6只小鼠进行麻醉,直接断颈处死后,解剖出小鼠大脑并分离出MPFC,将MPFC匀浆后提蛋白检测MPFC内毒性Aβ40、毒性Aβ42、磷酸化Tau蛋白(p-Tau)的表达。结果:1、体质量:FLX干预前,4组小鼠之间的体质量无显著性差异;从FLX干预第一周起至FLX干预结束,每组小鼠的体质量干预前和干预后相比均无显著性差异;FLX干预结束后,4组小鼠的体质量均无显著性改变。2、旷场测试:在本研究中,FLX干预后,4组小鼠旷场试验中的各项指标(包括旷场内活动总路程,旷场中央路程,旷场中央路程百分比,旷场中央区活动时间,旷场活动时间百分比以及平均速度)均未见显著性差异。3、水迷宫测试:4组小鼠的平均速度无显著性差异。其中,AD+NS小鼠的逃避潜伏期较WT+NS小鼠的逃避潜伏期显著性延长(p<0.01),AD+FLX小鼠的逃避潜伏期与AD+NS小鼠的逃避潜伏期相比显著性缩短(p<0.05),AD+FLX小鼠的逃避潜伏期与WT+FLX小鼠的逃避潜伏期相比无显著性差异;AD+NS小鼠穿越平台次数与WT+NS小鼠相比显著性减小(p<0.01),AD+FLX小鼠穿越平台次数较AD+NS小鼠显著性增加(p<0.05),4组小鼠的目标象限游泳的时间百分比无显著性差异。4、Y迷宫测试结果:与WT+NS小鼠比较,AD+NS小鼠正确交替次数百分比显著减少(p<0.01);与AD+NS小鼠比较,AD+FLX正确交替次数百分比显著增加(p<0.01)。5、MPFC的体积计算结果:AD+NS小鼠的MPFC体积显著小于WT+NS小鼠(p<0.05),而氟西汀干预后,AD+FLX小鼠的MPFC体积显著大于AD+NS小鼠(p<0.01),AD+FLX小鼠和WT+FLX小鼠之间的MPFC体积则无显著性差异。6、10月龄AD+NS组小鼠MPFC内不可溶的毒性Aβ40和Aβ42的表达显著大于WT+NS组小鼠(p<0.01),而AD+NS组小鼠和AD+FLX组小鼠MPFC内不可溶的毒性Aβ40没有显著性差异,AD+FLX组小鼠MPFC内不可溶的毒性Aβ42的表达显著低于AD+NS组小鼠(p<0.01)。7、10月龄WT+NS组小鼠和WT+FLX组小鼠MPFC内没有老年斑沉积,而相同月龄AD+NS小鼠和AD+FLX小鼠MPFC内均有少量的Aβ斑沉积,但AD+FLX组小鼠MPFC内沉积的Aβ斑块的大小和数量均要小于AD+NS组小鼠MPFC内沉积斑块的大小和数量。8、AD+NS组小鼠MPFC内p-Tau+(ser396)细胞密度显著高于相同月龄WT+NS组小鼠(p<0.01),AD+FLX 组 MPFC 内 p-Tau+(ser396)细胞密度显著低于相同月龄AD+NS组小鼠(p<0.05)。ELISA结果显示,10月龄AD+NS组小鼠MPFC内p-Tau蛋白表达显著高于相同月龄WT+NS组小鼠(p<0.01),10月龄AD+FLX组MPFC内p-Tau蛋白表达显著低于相同月龄AD+NS组小鼠(p<0.01)。结论:1、2个月的氟西汀干预可以显著改善转基因AD小鼠的空间学习记忆能力。2、10月龄的APP/PS1转基因AD小鼠已出现工作记忆障碍,2个月的氟西汀干预可以延缓转基因AD小鼠的工作记忆能力的减退。3、10月龄时,APP/PS1转基因AD小鼠MPFC内有Aβ斑块沉积,并且不可溶毒性Aβ40和Aβ42表达显著升高,而FLX治疗可以减少老年斑的形成和降低Aβ42的表达从而减小MPFC的毒性反应。4、10月龄时,APP/PS1转基因AD小鼠MPFC内p-Tau蛋白和p-Tau+(ser396)的表达显著增加,而FLX治疗可以减少p-Tau蛋白和p-Tau+(ser396)的表达水平从而减轻MPFC内神经原纤维的缠结。5、体视学精确定量研究发现10月龄的APP/PS1转基因AD小鼠的MPFC体积存在显著性萎缩,2个月的氟西汀干预可以延缓转基因AD小鼠MPFC的萎缩。第二部分氟西汀对AD转基因小鼠内侧前额叶皮质内神经元的作用及其可能机制研究目的:研究氟西汀(FLX)对处于刚发生行为学改变时的转基因早期AD小鼠大脑内侧前额叶皮质内神经元的作用及其可能的作用机制研究,为寻求防治AD的干预新方法提供一定的实验依据。方法:在第一部分行为学检测结束后,获得的8组含有MPFC结构的连续等距切片中,随机抽取2组等距切片,运用免疫组织化学染色方法进行anti-DCX染色,运用体视学定量研究方法计算MPFC内神经元的数目和DCX+神经元细胞的数目,余下一组的等距切片则运用免疫荧光染色方法观察MPFC内5HT4R+/NeuN+神经元的情况以及海马内BrdU+/NeuN+新生神经元的情况。结果:1、MPFC内总神经元数目的体视学定量结果:AD+NS组小鼠的MPFC内神经元总数目显著小于WT+NS组小鼠(p<0.05),而AD+FLX组小鼠的MPFC内神经元总数目显著大于AD+NS组小鼠(p<0.05),AD+FLX组小鼠和WT+FLX组小鼠之间的MPFC神经元总数目则无显著性差异。2、MPFC内DCX+神经元(未成熟神经元)的体视学定量研究结果:AD+NS组小鼠的MPFC内DCX+神经元总数目显著小于WT+NS组小鼠(p<0.01),而AD+FLX组小鼠MPFC内DCX+神经元总数目显著大于AD+NS组小鼠(p<0.01),WT+FLX组小鼠MPFC内DCX+神经元总数目显著大于AD+FLX组小鼠(p<0.05)。3、BrdU+/NeuN+神经元(成熟的新生神经元)免疫荧光的染色结果:AD+NS组小鼠的MPFC内BrdU+神经元密度显著小于WT+NS组小鼠(p<0.01),而AD+FLX组小鼠MPFC内BrdU+/NeuN+神经元密度显著大于AD+NS组小鼠(p<0.05)。4、5HT4R+/NeuN+神经元(5HT4R+/NeuN+细胞)免疫荧光的染色结果:AD+NS组小鼠的MPFC内5HT4R+/NeuN+神经元密度显著小于WT+NS组小鼠(p<0.01),而AD+FLX组小鼠的MPFC内5HT4R+/NeuN+神经元密度显著大于AD+NS 组小鼠(p<0.05)。结论:1、10月龄时,APP/PS1转基因AD小鼠MPFC内神经元显著性丢失,FLX干预可以减少转基因AD小鼠MPFC内神经元的丢失。2、10月龄时,APP/PS1转基因AD小鼠MPFC内新生神经元形成能力和存活能力均减弱,FLX干预可以促进转基因AD小鼠MPFC内新生神经元的形成和存活。3、10月龄时,APP/PS1转基因AD小鼠MPFC内神经元上5HT4R的表达显著性降低,FLX干预可以增加转基因AD小鼠MPFC内神经元上5HT4R的表达,提示FLX也许是通过增加或者激活5HT4R的表达来保护转基因AD小鼠MPFC内神经元的丢失和新生神经元的形成和存活能力。第三部分氟西汀对AD转基因小鼠内侧前额叶皮质内突触的作用及其可能机制研究目的:研究氟西汀干预对转基因AD小鼠发生行为学改变的早期大脑内侧前额叶皮质内突触的作用及其可能的作用机制,为寻求防治AD的干预新方法提供一定的实验数据。方法:在第一部分行为学检测结束后,获得的8组含有MPFC结构的连续等距切片中,随机抽取2组等距切片,运用免疫金染色进行anti-spinophilin染色,运用现代体视学方法计算 MPFC内树突棘的数目,余下的一组等距切片则运用免疫荧光染色后观察MPFC内PSD95+突触的情况以及5HT1AR+神经元的情况。另外在第一部分行为学测试后每组小鼠各随机选取6只小鼠进行麻醉,直接断颈处死后解剖出小鼠大脑并分离出MPFC,将MPFC匀浆后提蛋白检测MPFC内突触素(SYP)、GSK3β、p-ser9-GSK3β、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经元活性蛋白c-fos的表达情况。结果:1、MPFC内spinophilin+树突棘突触的体视学定量结果:AD+NS组小鼠的MPFC内树突棘突触总数目显著小于WT+NS组小鼠(p<0.05),而氟西汀干预后,AD+FLX组小鼠的MPFC内树突棘突触总数目显著大于AD+NS组小鼠(p<0.05),AD+FLX组小鼠和WT+FLX组小鼠之间的MPFC内树突棘突触总数目则无显著性差异。2、5HT1AR+/NeuN+神经元免疫荧光的染色结果:AD+NS组小鼠的MPFC内5HT1AR+/NeuN+神经元密度显著小于WT+NS组小鼠(p<0.01),而AD+FLX组小鼠的MPFC内5HT1AR+/NeuN+神经元密度显著大于AD+NS组小鼠(p<0.05)。3、Anti-PSD95免疫荧光的染色结果:对单位面积内PSD95+突触的荧光强度进行定量后,AD+NS组小鼠MPFC内PSD95的表达显著少于WT+NS组小鼠(p<0.01),而AD+FLX组小鼠和AD+NS组小鼠MPFC内PSD95的表达无显著性差异(p>0.05)。4、10月龄AD+NS组小鼠MPFC内SYP表达显著低于相同月龄WT+NS 组小鼠(p<0.01),10 月龄 AD+FLX 组 MPFC 内 SYP 表达显著高于相同月龄AD+NS组小鼠(p<0.01)。5、10月龄AD+NS组小鼠MPFC内GSK3β蛋白表达显著高于相同月龄WT+NS组小鼠(p<0.01),AD+FLX组MPFC内GSK3β蛋白表达显著低于相同月龄AD+NS组小鼠(p<0.01)。并且,10月龄AD+NS组小鼠MPFC内p-ser9-GSK3β和β-catennin蛋白的表达与相同月龄WT+NS小鼠相比显著性减少(p<0.01,p<0.01),AD+FLX 组 MPFC 内 p-ser9-GSK3β 和 β-catennin 蛋白的表达与相同月龄AD+NS组小鼠相比显著性增加(p<0.01,p<0.01)。6、10月龄AD+NS组小鼠MPFC内c-fos表达显著低于相同月龄WT+NS组小鼠(p<0.01),AD+FLX组MPFC内c-fos表达显著高于相同月龄AD+NS组小鼠(p<0.01)。7、10月龄AD+NS组小鼠MPFC内BDNF表达显著低于相同月龄WT+NS组小鼠(p<0.01),AD+FLX组MPFC内BDNF表达显著高于相同月龄AD+NS组小鼠(p<0.01)。结论:1、10月龄时,APP/PS1转基因AD小鼠MPFC突触显著性丢失,FLX干预可以显著地减少转基因AD小鼠MPFC内突触的丢失。2、10月龄时,APP/PS1转基因AD小鼠MPFC内神经元上的5HT1AR显著减少,FLX干预可以提高转基因AD小鼠MPFC内神经元上的5HT1AR表达水平。3、FLX激活经典Wnt通路的关键分子可能是FLX保护MPFC内突触丢失的机制之一。4、10月龄时,APP/PS1转基因AD小鼠MPFC内BDNF和c-fos蛋白的表达显著降低,而FLX治疗可以增高BDNF和c-fos蛋白的表达。5、FLX也许是通过激活或增加5HT1AR来增强AD小鼠MPFC内神经元兴奋性和增加 BDNF的表达及神经突触的可塑性,减少突触丢失,从而改善AD小鼠的认知功能障碍。