那西肽是一种新型的非吸收型饲料药物添加剂,为含硫多肽类抗生素家族中的一员。由于其安全性高,无残留,毒性小,无交叉耐药性,易降解,对环境污染小等特点,那西肽被广泛应用于畜牧业和水产业养殖中,具有巨大的市场价值和广阔的应用前景。本文采用基因组重排技术定向育种选育那西肽高产菌株,对筛选到的高产融合菌株进行形态分化、遗传特征、发酵罐放大验证试验,并对发酵产物进行分离、纯化和鉴定。活跃链霉菌(Streptomyces actuosus)经60Co-γ辐照和LiCl复合诱变,琼脂块初筛、发酵复筛,筛选到17株比原始菌株产量高的诱变菌株,其中500 Gy诱变条件下筛选到11株(其中诱变菌株Y5-10的效价是原始菌株效价的138.10%),正突变率为12.94%,300 Gy和700 Gy条件下分别筛选到2株和4株(均挑取约85个单菌落筛选),正突变率分别为2.35%和4.71%。选取其中5株效价较高的菌株Y3-2、Y5-3、Y5-8、Y5-10、Y7-1作为基因组重排出发菌株。通过对原生质体融合参数的考察,选择酶浓度为2.00 mg/ml,酶解时间为120 min,酶解温度为35 ℃,融合温度为25 ℃,融合时间为20 min。选取链霉素作为原生质体抗性筛选压力,28℃培养。采用上述条件下经过4轮原生质体融合筛选选育出3株那西肽高产菌株,其中D92发酵效价单位达到1148.15 mg/L,是融合出发菌株Y5-10的5.12倍,是原始菌株的6.86倍。并经5次传代,其遗传性能稳定。对链霉菌核糖体S12蛋白编码序列测序,结果表明:与原始菌株相比,融合菌株D92的核糖体S12蛋白序列在1-6位之间以及88位的氨基酸发生了突变,即 G2P,A3R,L5Q,L6Q 和 K88R。研究液体深层培养条件下的菌丝形态分化,结果表明:融合菌株D92在培养前期由带横隔的菌丝逐渐生长成团,在48-60 h,菌丝生长不明显,为停滞期的表现,而后新的细胞快速生长,到96 h菌丝团直径达最大,此时,菌丝团核心出现明显的凋亡现象。108 h开始,菌丝出现明显的自溶,菌丝直径减小,最终断裂成片段。原始菌株菌丝形态分化与融合菌株相比,生长周期更短,菌丝团直径也更小,生长停滞期也明显提前(36-48 h)。对融合菌株D92和原始菌株的生长曲线进行测定,结果表明:融合菌株的菌浓明显高于原始菌株,在前期快速生长阶段菌丝生物量急剧增加,而代谢产物那西肽基本不合成,生长停滞阶段细胞生长量略有增加,而后大量减少,次级代谢产物继续积累,在96 h那西肽的发酵单位达到最大值,比出发菌株明显推迟。可知形态分化周期与次级代谢产物的合成积累有一定的关联,且可推知菌丝团直径增长停滞阶段及凋亡的延滞将使得发酵产物那西肽有很好的积累,那西肽的生物合成也主要集中在这一阶段。因此推测菌丝团形成与分化对于那西肽的产物合成积累可能有重要的意义。将融合菌株D92进行10 L发酵罐的放大培养,对其还原糖含量(葡萄糖)、总糖含量、氨基氮、pH、效价等进行测定,结果表明:pH先略有上升,然后下降,再回升;还原糖和总糖在整个发酵过程均被有效利用而不断降低;氨基氮在前96 h也迅速降低,而后由于碳源浓度不足引起菌体自溶,氨基氮快速升高;在发酵的前期,发酵单位积累缓慢,在发酵中期,产物快速积累,并在108h达到最大值(1541.37mg/L)。采用有机溶剂萃取法和大孔树脂吸附法对发酵产物进行分离和纯化,结果表明:大孔树脂吸附法操作简单,效率高,得到的发酵产物组分活性也更高,说明大孔树脂对那西肽的发酵产物有很好的分离效果。进一步验证分离得到的物质是那西肽,将分离组分物质和那西肽标准物分别溶解,进行波长扫描、薄层色谱分析和高效液相分析;另外用中红外对分离组分物质进行官能团确定,和用一级质谱对其相对分子量进行验证。结果都表明分离得到的物质就是那西肽。