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目的:原发性肝癌(primary liver cancer,PLC),是全世界最常见的恶性肿瘤之一,是第三位肿瘤致死性病因。我国肝癌患者约占全球病例总数的一半,肝癌的晚期诊断是导致死亡率居高不下的重要原因。肝癌的早期诊断、早期预防是降低死亡率的重要举措。甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP)是目前临床应用最为广泛的诊断标志物,但有20~30%的患者血清中AFP水平并不升髙,仅以其作为诊断标志性数据,可能造成一定比例的遗漏或误判,因此需要新的肿瘤生物标志物共同辅助肝癌的诊断。肿瘤相关抗原(Tumor-associated antigens,TAAs)是临床上肿瘤标志物检测的主要靶标,肿瘤相关自身抗体是机体对肿瘤相关抗原进行体液免疫应答的产物。许多研究发现癌症患者血浆中自身抗体的存在,它们具有许多目前肝癌筛查手段不具备的优势,如结构稳定、不易降解、半衰期长等,而最重要的是自身抗体出现较早,在临床症状出现之前甚至在癌前病变中即检测到其存在。本研究主要通过设计并合成的线性抗原肽检测肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)患者血浆中自身抗体的变化,试图寻找一种或几种能用于HCC诊断或预后评估的生物学标志物。方法:通过查阅文献,本研究纳入CD25、OCT4、p16、BIRC5、c-myc、ANXA-1这6种目标蛋白,根据课题组前期工作基础,优化抗原多肽设计以提高抗原多肽的稳定性及检测抗体的效力,将来源于同一种蛋白的不同抗原表位设计成独立的多条线性抗原肽,以寻找能够触发机体体液免疫应答的关键表位。本研究共纳入首次诊断且未经任何治疗HCC122例及与其性别、年龄相匹配的健康对照231例,运用优化的ELISA法检测HCC组和健康对照组血浆中相应自身抗体的表达水平,应用SPSS22.0进行数据统计和分析,从性别、年龄、巴塞罗那分期(Barcelona clinic liver cancer,BCLC)层面比较两组自身抗体表达水平的差异;在HCC组内根据AFP、肿瘤大小、是否合并血管受累及肝外转移进行亚组分析。运用ROC曲线分析不同抗体对肝癌诊断的价值,同时结合HCC患者的临床随访信息,运用kaplan-Meier曲线及Cox回归探讨自身抗体的水平与HCC患者总生存期(OS)之间的关系及影响患者预后的因素。结果:(1)CD25自身抗体的表达情况。与健康对照相比,HCC患者血浆CD25 IgG水平显著增高(P<0.001)。CD25 IgG在不同性别、年龄HCC患者中表达均较健康对照增加。B期、C+D期患者血浆中CD25 IgG的表达较健康对照显著增加(P<0.001;P<0.001),并且随着肿瘤的进展表达逐渐增加。CD25 IgG水平在AFP高表达组中较AFP正常或低表达组显著增高(P=0.004)。肿瘤<3cm组CD25 IgG水平明显低于3-5cm和≥5cm组CD25 IgG水平(P=0.025)。ROC分析结果显示,当特异度为95.0%时,CD25 IgG诊断HCC的敏感度为14.8%。(2)OCT4自身抗体的表达情况。与健康对照相比,HCC患者血浆OCT4 IgG水平显著增高(P<0.001)。OCT4 IgG在男性、女性HCC患者中表达均较健康对照增加,但无性别差异。与同年龄层健康人群相比,年龄≥50岁的HCC患者中血浆OCT4 IgG水平明显升高(P<0.001);亚组分析显示,OCT4 IgG表达在血管受累阳性组明显高于血管受累阴性组(P=0.019)。0+A期、B期、C+D期患者血浆中OCT4 IgG的表达较健康对照均显著增加(P=0.031;P=0.002;P<0.001),并且随着肿瘤的进展表达逐渐增加。ROC分析结果显示,当特异度为95.0%时,OCT4 IgG诊断HCC的敏感度为18.9%。OCT4 IgG对C+D期HCC诊断的敏感度达到了26.9%。Kaplan-Meier生存分析发现HCC患者血浆中OCT4 IgG的表达与预后呈负相关。多因素Cox回归分析发现BCLC分期、肝外转移、血管受累及OCT4 IgG水平是影响肝癌患者预后的重要的因素。(3)p16自身抗体的表达情况。与健康对照相比,HCC患者血浆p16a IgG水平显著增高(P<0.001)。p16a IgG在不同性别、年龄HCC患者中表达均较健康对照增加。B期、C+D期患者血浆中p16a IgG的表达较健康对照显著增加(P<0.001;P<0.001),并且随着肿瘤的进展表达逐渐增加。ROC分析结果显示,当特异度为95.0%时,p16a IgG诊断HCC的敏感度为17.2%。尝试用改良方法检测p16a,得到相近的结果,诊断HCC的敏感度为11.4%。并且来源于同一蛋白的抗原多肽在HCC患者中的表达趋势也不尽相同。与健康对照相比,HCC患者血浆p16b IgG水平差异无显著统计学意义(P=0.981)。(4)BIRC5、c-myc、ANXA-1自身抗体的表达情况。与健康对照相比,HCC患者血浆BIRC5a、BIRC5b、c-myc、ANXA-1 IgG水平差异无显著统计学意义(P=0.376;P=0.529;P=0.301;P=0.062)。结论:(1)CD25、p16a自身抗体水平在中、晚期HCC患者血浆中显著增高,对HCC具有一定的诊断价值。CD25自身抗体水平在AFP高表达组中较AFP正常或低表达组显著增高。CD25自身抗体检测可以与AFP联合,共同辅助肝癌的诊断。(2)OCT4自身抗体在HCC患者中表达水平随BCLC分期明显升高,OCT4自身抗体水平与预后呈负相关,OCT4自身抗体可能是HCC的潜在生物学标志物,对HCC预后评估有进一步开发的价值。(3)p16b、BIRC5、c-myc、ANXA-1自身抗体的表达水平在两组之间均未见差异,课题组既往发表研究结果显示这些自身抗体水平在其它肿瘤中异常表达,这说明不同组织类型中自身抗体表达水平不同,其具有较高的器官特异性。(4)抗原多肽设计方法及优化的ELISA检测方法显示出了良好的抗体检测效力;通过设计多条同源抗原多肽的方法,筛选出了p16蛋白结构中触发机体免疫应答的关键表位,为今后优化抗体检测及临床应用奠定了基础。