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目前全世界约有15%-20%的育龄夫妇受到不育难题的困扰,且不育症的病因、诊断及治疗尚不明确,为了揭示免疫性不育的机制,本课题应用免疫共沉淀,联合液相色谱串联质谱技术,筛选与抗精子抗体结合的精子膜蛋白,并通过软件对筛选得到的蛋白进行生物信息学分析。这些蛋白可能成为免疫性不育诊断和治疗的新靶点。选取不明原因不孕症患者血清标本,采用ELISA抗精子抗体检测试剂盒进行阳性血清的初筛,再应用混合抗球蛋白试验对抗精子抗体阳性血清进行确认试验,得到抗精子抗体阳性血清标本纳入疾病组,同时选取正常查体的抗精子抗体阴性且已正常生育过的健康人血清标本作为对照组。选取在中国人民解放军总医院行正常查体男性精液标本48例,混合后提取精子膜蛋白。然后将精子膜蛋白分别与疾病组血清和对照组血清孵育,再分别加入蛋白A/G(Protein A/G)孵育,进行免疫共沉淀反应,采用SDS-PAGE对免疫沉淀复合物进行分离,切胶酶解后,进行液相色谱串联二级质谱分析,得到相应的蛋白ID。通过UniProt数据库检索查找这些蛋白的名称、生物学功能、细胞定位等信息。采用David软件对蛋白进行GO分类注释及Pathway分析。筛选出抗精子抗体阳性不育患者血清56例(女性39例、男性17例),抗精子抗体阴性正常生育者血清30例(女性17例、男性13例)。质谱分析共鉴定出107种精子膜蛋白分别是:(1)仅与正常组血清相结合的蛋白(13种);(2)既与正常组血清结合又与疾病组血清结合的蛋白(14种);(3)仅与疾病组血清结合的蛋白(80种)。通过UniProt和DAVID软件对鉴定出的蛋白进行生物信息学分析,根据生物学功能又从仅与疾病组血清结合的蛋白中筛选出15种免疫性不育相关抗原,分别是精子阳离子通道蛋白1,精子阳离子通道蛋白3,精子阳离子通道蛋白4,精子相关抗原9,载脂蛋白A-I,轴丝动力蛋白重链14,多波段多肽-2,精卵融合蛋白4,硫氧还蛋白结构域蛋白2,含有蛋白H的IQ域,含有蛋白F1的IQ域,精子发生相关蛋白5,精子发生相关蛋白5样蛋白1,精子顶体膜相关蛋白1,E3泛素蛋白连接酶RNF114。后期对载脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I,APOA-I)和精子阳离子通道蛋白1(sperm cation channel protein 1,CatSper1)两种蛋白通过免疫印迹及免疫荧光试验对两种蛋白在精子细胞中的定位进行研究;抗APOA-I抗体、抗CatSper1抗体处理精子细胞后通过透射电镜观察精子微细结构的变化并运用计算机辅助精液分析系统观察其对精子活力的影响。研究结果表明,采用免疫共沉淀联合液相色谱串联二级质谱分析技术,鉴定出15种可能与免疫性不育相关的候选蛋白,有助于揭示免疫性不育相关机制。对APOA-I和Cat Sper1这2种蛋白进行验证试验,发现这2种蛋白确实存在于人类精子细胞,而且蛋白相应抗体处理精子细胞后发现精子头部质膜、尾部线粒体等微细结构发生变化,精子活力降低。鉴定出这些蛋白有助于理解受精相关分子机制,免疫性不育的诊断和治疗及免疫避孕疫苗的研发。