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自体或异基因移植是目前治疗白血病及部分其他恶性肿瘤、遗传性疾病的一种有效方法。自身移植时，可因移植物中残留的肿瘤细胞回输而复发；异基因移植财，可因供体移植物中的T淋巴细胞而致移植物抗宿主病（GVHD）。 移植后植活成功与否取决于移植物中的“种子细胞”——HSPC的数量与质量，后者的表面带有重要的分化标志：CD34抗原。CD34+HSPC存在于多种造血组织中，但其所占有核细胞（NC）的比例很低。国外研究表明，利用CD34抗原这一标志。通过适当的方法可以达到富集CD34+HSPC，净化CD34-肿瘤细胞和T淋巴细胞，从而可减少复发或GVHD的目的。 富集CD34+细胞的方法主要有阴性选择和阳性选择。阴性选择是指采用适当的方法去除移植物中CD34-细胞，富集CD34+细胞的过程，方法包括密度梯度离心、吞噬磁珠、尼龙毛吸附、大豆凝聚素或免疫磁珠法等。阳性选择是利用抗CD34单克隆抗体（单抗）与某些介质连接，并通过物理或生物的方法将CD34+HSPC从移植物中特异性地分选出来，从而达到纯化CD34+细胞、降低肿瘤细胞和T淋巴细胞残留的目的，主要方法有亲和柱法、免疫磁珠法等，这些方均可以有效地富集CD34+细胞，并净化肿瘤细胞和T淋巴细胞。一般来说，阳性选择获得的CD34+细胞纯度远高于阴性选择。目前可以用于临床量标本处理的磁珠直径有4.5μm和50nm两种。使用4.5μm磁珠时，与细胞结合的磁珠必须去除才能被输入体内。使用50nm磁珠时，与细胞结合的磁珠不必被去除，可直接输入体内。但后者的价格远高于前者，限制了它们在国内临床移植工作中的普遍应用。 羰基铁粉（carbony1 iron，CI）是一种高度纯化的五阶羰基铁微粒（Fe[CO]5），直径≤5μm，可高温消毒，价格便宜，对人体毒性极小。以往主要用于去除血或骨髓（BM）标本中的单核/巨噬细胞后从事基础实验研究。国内外尚未见将其用于富集CD34＋细胞的报道aNimgaonkar等曾用CD15兔疫磁珠清除了AML患者BM或PBSC中 7个对数级的白血病细胞和 1－4个对数级的CD15＋细胞，不仅净化了白血病细胞，而且富集了CD34＋细胞。但国内未见用CD15富集CD34＋细胞的报道。本研究试图采用CI或CD15 IMB和高能量磁铁作阴性选择，以去除BM、外周血干／祖细胞（PBS）中的CD34－吞噬细胞或单核细胞，富集CD34＋细胞和降低移植物作进一步CD34阳性选择前的起始细胞数量，为临床推广使用 50urn磁珠进行 CD34阳性细胞选择，纯化造血干／祖细胞降低成本提供实验依据。 以免疫磁珠法进行CD34阳性选择虽可净化自身移植物中的CD34的肿瘤细 胞或去除异基因移植物中的T淋巴细胞，但由于缺乏一种精确的评价方法，使移植物移植后病人是否会出现原发肿瘤复发和 GVHD发生的危险性难于预测。如能在体外事先精确评价将被采用的净化方法的有效性，则可大大减少人力与物力。 准确评价净化的效果有赖于敏感、可靠的评价方法。通常采用免疫染色或PCR的方法对净化效果进行评价，但这些方法在测得残留肿瘤细胞量与实际残留肿瘤细胞量之间存在着较大的差异，因此难以准确评价净化方法的有效性和安全性。Paulus等曾采用Hoescht33342（H342）标记淋巴瘤细胞种入PBSC建立移植物细胞模型，采用紫外光激发产生荧光的方法，以荧光显微镜分析CD34 阳性选择后残留肿瘤细胞的净化效果，使实验结果直观。准确。然而，用H342染料标记肿瘤细胞需用紫外光激发才能观察，由于大多数流式细胞仪（FCM）通 常不装备紫外激光光源，且H342染料容易漏出细胞外，给精确评价带来不便。 Calcein叭M是一种荧光染料，它很容易穿透细胞膜进入细胞 内，在酯酶的催 化下，能转化成带有荧光的衍生物滞留于活细胞内。在常用氖激光源蓝色激发 光（波长488urn）的激发下，能产生绿色荧光，并很容易用FCM观察和分析。国 内外未见用该染料建立移植物细胞模型用于评价体外净化的报道。本研究采用 Calcein叭M染料标记肿瘤细胞种入背景细胞中建立儿个移植物细 胞模型，以 FCM精确评价CD34阳性选择后肿瘤细胞清除效率和 CD34＋细胞的 富集效果， 并为寻找更有效的体外净化方法或肿瘤杀伤疗法提供体外实验依据。 2 第一部分 阴性选择 材料与方法1．标本：取肝素钠抗凝 BM 9份，常规分离获得单个核细胞（MNC）；另驭冻存 的 PBSC 9份，解冻后分离除去死细胞。2．方怯：分别以碳基铁粉（CI）、CD15免疫磁珠（IMB）或两者联合选择的方法 作阴性选择以富集 CD34＋细胞。以流式细胞仪（FCM）检测 CD34＋细胞含量， 计算并比较选择前及三种方法选择后的CD34＋细胞含量、富集倍数、总细胞 回收率和 CD34＋细胞回收率。 结 果1．用CI 对BM 或PBSC 进行阴性选择，选择后CD34＋细胞含量分别为 （3．52士1．75）0／5。34士3．54)％，均比选择前（1．88士1，12）％、(3．49士2．48