强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis,AS)是一种以慢性炎症和异常骨化为特征的自身免疫性疾病。世界范围内各个国家和种族基本都存在AS患者,而且AS病患人群数量庞大。我国AS患病率约0.3%,鉴于我国巨大的人口基数,AS病人数量接近400万;AS临床特征表现为慢性炎症反应和新骨形成、异常骨化。AS致残率很高,病人在长期遭受背痛、腰痛、关节痛的折磨后,人体的中轴骨和四肢关节结构进行性破坏,最终出现关节骨性僵直,进而导致颈部、腰部和下肢行动能力的减弱,甚至完全丧失活动能力。其中,AS患者中有73%会出现外周关节受累,其中髋关节韧带骨化发生率为25%-50%,而这些患者中有50%-90%会累及双侧髋关节。除此之外,AS伴发全身性并发症,可累及眼睛、肠道、肺、肾、心脏、血管、皮肤、骨和中枢神经等多个重要组织和器官。目前,AS的治疗仅能做到缓解炎症反应,但是缓解的机理尚不清除。对于新骨形成、异常骨化尚无任何治疗手段。因此,对于AS这种疾病需要进一步去了解,需要采取更多的研究手段加深认识。近年来蛋白质组学已成为生命科学的前沿领域之一。蛋白质组学是采用大量精密的数据分析手段,以功能谱和表达谱的形式表现有机体的本质,以达到所有的蛋白基因表达的研究。采用2D-Nano-LC-ESI-MS/MS蛋白组学研究技术,可以大大提高差异蛋白质的检出率,远远高于传统的固相2D蛋白质组学研究方法,现在已经成为最新的蛋白质组学研究手段。国际上对AS的蛋白质组学研究现在只处在初步阶段,仅有几篇以血液细胞为实验材料的报道。强直性脊柱炎(AS)的蛋白质组学分析比较患者与对照韧带成纤维细胞样细胞的蛋白表达差异,阐明强直性脊柱炎(AS)的发病机制是本课题的研究目的。第一章强直性脊柱炎韧带组织比较蛋白质组学研究利用晚期发生韧带骨化或具有骨化倾向的AS患者的病变韧带组织和正常人韧带组织,首先进行原代成纤维细胞培养,获得了35例AS样本,10例正常对照样本。再采用shot-gun法lable-free方式进行强直性脊柱炎韧带成纤维细胞的比较蛋白质组学研究,寻找存在于AS患者及正常人的韧带组织中的差异表达蛋白。利用蛋白质组学技术,对正常人和患者的蛋白质组进行比较分析,以找出该疾病的特异性蛋白分子,先通过二维液相色谱-质谱技术对样品中的所有蛋白质进行分离,Deltavue软件被用来确定疾病组和正常对照组蛋白表达的“质量”(乙酰化和磷酸化修饰)和“量”(表达)的差异,然后不同的手段,例如质谱鉴定或者是氨基酸序列的推测及构建,以达到确定蛋白质的目的,利用生物信息学方法预测蛋白质结构和可能的功能筛选候选基因;发现β脂肪酸氧化通路中的6个蛋白上调显著(HADHB,ECHS1,ACSL4,ACADM,ACSL1和HADH)而INSR通路(INSR,IRS1,PI3K和PKC)蛋白却下调表达。其次,通过聚合酶链反应、蛋白印迹和质谱等技术对这些蛋白的表达进行了验证。同时,结合临床数据发现,AS患者BMI和BMIZ评分显著低于正常人。以上这些结果提示β脂肪酸氧化通路减少了AS患者体内的脂肪储备,这一点首次通过基础实验数据证明。第二章膜联蛋白A2在强直性脊柱炎致病过程中的功能研究强直性脊柱炎在结构上主要是由于新骨的形成而导致结构损伤,进而使得中轴骨发生骨化强直。骨组织发育需要多种因子共同参与的过程,这些因子包括Osterix蛋白(OSX)、runt相关基因2(Runx2)、转化生长因子p、骨钙素(OCN)、碱性磷酸酶(ALP)以及骨形成蛋白2(BMP2)等。调控破骨细胞分化的细胞因子主要包括:骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、核因子κB受体活化因子(receptoractivator of nuclear factor-kappa B,RANK)及核因子κB受体活化因子配体(receptoractivator of nuclear factor-kappa B ligand,RANKL)。目前,对于强直性脊柱炎的体外模型,报道较少,我们以Annexin A2的高表达为指标,发现IL-6诱导原代的韧带成纤维细胞,可以升高Annexin A2,因此采用此种模型进行Annexin A2功能考察。我们用A2蛋白干扰序列转染方法和杂交Western检测方法,考察了BMP2、OCN、OPG、OSX、ERK1/2、RANK以及RANKL的表达水平,结果发现Annexin A2干扰序列能够抑制BMP2、OCN、OPG、OSX的高表达以及ERK1/2磷酸,同时还能够促进RANK、RANKL的表达,因此我们推测Annexin A2干扰序列对于强直性脊柱炎的影响,一方面可以通过抑制的ERK1/2的磷酸化达到控制炎症的作用;另一方面可以通过对骨形成因子(BMP2、OCN、OPG、OSX)的调节,达到抑制新骨形成的作用;同时Annexin A2干扰序列还能够提高破骨细胞因子RANK、RANKL的表达,促进破骨细胞的生成,从而抑制破骨细胞的增殖和分化。同时我们设计合成了Annexin A2过表达序列,考察了Annexin A2过表达序列对IL-6诱导原代的韧带成纤维细胞的影响,结果发现成骨细胞因子(BMP2、OCN、OPG、OSX)高表达,同时还抑制了破骨细胞因子(RANK、RANKL)的表达,而在Annexin A2过表达载体植入的原韧带成纤维细胞中加入ERK1/2抑制,Western blot检测发现与ERK1/2抑制相比,成骨细胞因子(BMP2、OCN、OPG、OSX)的表达有所升高,而破骨细胞因子(RANK、RANKL)的表达有所降低。因此,这一结果提示我们Annexin A2可能是通过ERK1/2信号通路来调控成骨细胞因子和破骨细胞因子的表达。