原发性肝癌(primary carcinoma of the liver,PCL)是临床上最常见的恶性肿瘤之一,死亡率高,是现代人类健康的巨大威胁。尤其在我国,肝癌的发病率与死亡率均位居世界前列,并且呈不断上升趋势。原发性肝癌种类很多,主要分为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)、肝胚细胞癌(hepatoblastoma)、胆管细胞癌(cholangiocarcinoma)和肉瘤(sarcoma)等,其中,肝细胞癌占肝癌的90%以上。肝癌的早期诊断、早期治疗对患者的预后及存活时间至关重要。甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)是1965年发现并报道的第一个具有诊断价值的肝癌特异性肿瘤标志物,也是现有诊断原发性肝癌的主要临床标志物之一,但是,大量的临床数据却发现,部分肝硬化患者AFP检测长期呈阳性,也仍约有30%以上肝癌患者血清AFP检测呈阴性。近年来,一些肝癌发生发展相关的信号通路得以阐释清楚,但是,肝癌早期诊断难,晚期预后差的情况并没有改变。因此,更加深入地了解肝癌的分子机制,寻找新的肿瘤标志物和诊断、治疗靶点的需求仍然迫在眉睫。我们在前期研究中,运用消减EMSA-SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXpotential Enrichment)技术,从伴肝外转移的血清AFP阴性肝细胞癌患者血清中筛选出候选标志物分子——VASN(Vasorin,slit like 2)蛋白,并通过实验证实了VASN在肝癌组织、肝癌细胞中的表达水平均高于正常肝组织和正常肝细胞,且VASN高表达对肝癌细胞的增殖、迁移有明显的促进作用。本课题的主要研究内容就是进一步对肝癌中VASN的表达调控机制进行探讨,课题主要分为以下两个部分:第一部分:VASN通过外泌体影响人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)的迁移。VASN是一个典型的Ⅰ型跨膜糖蛋白,受去整合素-金属蛋白酶17(ADAM metallopeptidase domain 17,ADAM17)剪切,分泌至血管循环中,发挥TGF-β(Transforming growth factor-beta,TGF-β)结合蛋白的作用。主要表达在动脉和富含血管的胎盘与肾脏等器官中。但VASN在正常肝组织、肝细胞中表达量很低,在肝癌组织、肝癌细胞中高表达。这说明VASN与肝癌发生发展有可能有密切关系。我们首先探索了VASN与血管内皮细胞之间的联系。VASN的蛋白结构表明细胞表达的VASN可以分泌至细胞外。我们检测了Hep G2细胞的培养上清,检测发现培养上清中含有大量的分泌型VASN。将Hep G2细胞培养上清与HUVEC共培养后,发现共培养后HUVEC中VASN的蛋白含量升高,而HUVEC中VASN的m RNA含量没有发生变化,提示HUVEC中含量上升的VASN蛋白可能来自于外源肝癌细胞的分泌。为了找到VASN在胞外的存在形式与功能方式,我们从细胞培养上清中纯化得到外泌体,并对外泌体及细胞培养上清中的VASN进行检测。结果发现,外泌体中能检测到VASN,培养上清中也能检测到VASN,除去培养上清中的外泌体后VASN的含量明显下降。以上结果证明VASN能够存在于外泌体中。检测不同肝细胞系外泌体VASN后发现,肝癌细胞Hep G2的外泌体VASN明显高于正常肝细胞L02与HUVEC的外泌体VASN。这与细胞内VASN的表达差异一致。这说明不同细胞外泌体VASN的含量与不同细胞中VASN的表达差别是一致的。收集Hep G2细胞培养上清中的外泌体,浓缩后以高浓度加入HUVEC培养基共培养,发现同样能在HUVEC细胞中检测到VASN。为了进一步证明外泌体VASN的转运,我们在Hep G2中过表达带myc标签的VASN,纯化收集带有myc标签的外泌体,随后将带myc标签的外泌体与HUVEC细胞孵育进行免疫荧光共定位实验,实验结果发现,带标签的外源VASN能在HUVEC细胞被检出。这表明,HUVEC中VASN水平的升高确实是摄取Hep G2来源的外泌体VASN而产生的。我们将Hep G2细胞培养上清及Hep G2来源的外泌体与HUVEC共培养,结果发现能够引起HUVEC迁移加快,但HUVEC增殖水平未见明显变化。这说明了,Hep G2来源的外泌体可作用于靶细胞并引起靶细胞功能改变。随后的实验中,我们通过改变Hep G2细胞的VASN水平,从而改变外泌体中VASN的含量。用VASN含量不同的外泌体与靶细胞HUVEC共培养,进而引起了共培养细胞HUVEC的迁移功能变化。这结果进一步说明了外泌体引起的靶细胞功能改变与外泌体内VASN的含量密切相关,VASN很有可能是一个重要的细胞因子,通过外泌体的转运,在肿瘤细胞与血管内皮细胞间传递信息,发挥其生物学功能。第二部分:mi R-152靶向ADAM17抑制人脐静脉内皮细胞增殖、迁移。ADAM17是ADAM家族成员之一,它能够作为金属蛋白酶激活肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)脱落分泌,同样也是VASN的重要调控分子。报道发现,ADAM17将膜型VASN的胞外区剪切脱落后,胞外区分泌至血液循环中作为分泌型VASN发挥生物学功能。近年来,越来越多的报道发现肿瘤的转移和侵袭与mi RNAs之间具有密切联系,mi RNAs通过调节细胞连接、细胞外基质降解、上皮间质转化(epithelial mesenchymal transformation,EMT)、血管形成等相关基因的表达发挥调控肿瘤发展的作用。因此,我们研究了mi RNAs对ADAM17的调控机制。生物信息学预测提示,ADAM17可能是mi R-152的靶基因之一,我们构建了包含及缺失mi R-152靶位点的ADAM17的3′-UTR荧光素酶报告基因载体,进行了双荧光素酶报告基因检测,发现mi R-152 mmics能结合并下调含有其结合位点的报告基因的荧光素酶活性,而对突变体没有影响。过表达mi R-152对ADAM17m RNA水平及蛋白水平均有负调节作用。在低氧状态下,mi R-152受低氧环境影响低表达,引起ADAM17表达升高,进而导致TNF-α脱落增多。用si RNA沉默ADAM17的表达,也能抑制肝癌细胞的侵袭和迁移,与mi R-152过表达的效果类似。从而证实了mi R-152在转录水平负性调控ADAM17,影响血管内皮细胞的增殖与迁移。