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核糖体被认为是蛋白质生成的场所,由核糖蛋白及rRNA组成。其中核糖蛋白不仅参与了核糖体的组装而且与mRNA翻译效率密切相关。人们研究显示,许多核糖蛋白基因的表达与癌症和一些生理疾病密切相关。本课题以真核生物特有的核糖蛋白yRPL36为研究对象,探讨酵母核糖蛋白yRPL36B的突变对核糖体组装的影响。在我们实验室的前期工作中,已完成了针对酵母核糖蛋白RPL36B的第88位,第98位,第99位氨基酸突变的引入及突变的彼此组合。我们将这一系列突变导入缺失内源yRPL36A和yRPL36B的酵母菌中,通过5-FOA剔除配合着RT-PCR的方法,来确保针对yRPL36B点突变成为细胞内唯一的RPL36蛋白来源。接下来我们采用spotting assay的方法检查yRPL36B突变对细胞生长的影响。为了研究方便,我们把mut1 (5’HA)(在yRPL36B的第88位氨基酸引入突变)作为本课题的研究菌种。一方面,我们按常规研究酵母核糖蛋白的思路即：采用抗yRPL36B和HA抗体,检测mut1 (5’HA)相比,yRPL36B (5’HA) dele.36, yRPL36B (dele.36)或FY251, yRPL36蛋白表达量上的变化。通过制备针对yRPS4B, yRPL36B, yRPL22A, yRPL10的RNA探针,检查在不同温度下mut1 (5’HA)相比于yRPL36B (dele.36)其它核糖蛋白在表达上是否有改变。利用绿色荧光蛋白EGFP,检查yRPL36B在mut1(5’HA)的细胞核中是否有明显积累。通过多聚核糖体分析的方法,发现yRPL36B突变会导致60s亚基的组装出现明显的问题,并产生明显的half-mer现象。采用翻译表达报告基因：与ATG识别相关的,容易产生移码的,内部介导翻译起始(IRES),检查yRPL36B突变是否会导致翻译细节上的改变。我们也试图通过一些高级结构预测和分析软件如：phyre, pymol去预测yRPL36B突变是否会导致空间结构的改变及了解yRPL36B在核糖体的具体空间位置及可能的作用位点。另外一方面,针对mut1 (5’HA)及yRPL36B (dele.36)酵母菌,我们不仅通过多聚核糖体分析结合高通量芯片技术,进行翻译效率的分析,而且通过高通量芯片技术进行表达水平上的分析。从翻译芯片中发现,在翻译水平上与核糖体生成相关的基因出现了明显的下调(且呈现家族性的改变)。从表达芯片中,针对有明显变化的核糖蛋白,利用pymol软件进行空间定位,发现了两个所谓的sub-complex。针对两张芯片(翻译芯片和表达芯片),发现参与能量代谢相关的基因,无论是转录还是翻译都出现了明显的上调。后续,我们通过polysome analysis结合q-PCR的方法在相同培养条件,不同温度下针对翻译效率有变化的,参与核糖体合成的一些基因及转录和翻译都有变化的,参与能量代谢的基因进行翻译效率的检测,发现基因翻译效率的变化与温度密切相关。同时我们针对翻译效率有明显变化的基因ADE1, HTA2, NOP7, LSG1, ZUO1进行lacZ报告系统的构建,以期望能够找到与翻译效率变化有关的区域。接下来我们在mutl (5’HA)和y36B (dele.36)背景下,针对LSG1,ZUO1添加myc标签,以方便在蛋白层面探讨与翻译效率改变之间的关系。我们也试图通过信息学方法,如：利用MEME在线预测motif,利用weblog针对ATG周围序列作图,利用RegRNA对已发现的motif进行分析等,希望能够找到引起翻译效率上调及下调的序列结构特征。同时,我们也针对其它核糖蛋白突变如yRPS14, yRPL11做翻译芯片,以方便和已有的mutl (5’HA)芯片比较。