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预先短暂的亚致死性缺血或其它亚致死性应激可对随后的损伤性缺血提供保护作用，此现象被称为缺血预处理。最先在心脏发现缺血预处理的保护作用，随后许多学者研究证实了在脑、脊髓、骨骼肌、肝脏、肾脏、肺脏和小肠等器官组织也存在缺血预处理现象。最近，有研究发现，一个器官的短暂缺血可诱导另一器官的缺血耐受，此现象被学者们称为远隔预处理。目前许多关于远隔预处理的研究是针对心脏和肾脏的，远隔预处理是否对脑也能提供保护作用还不清楚。但是神经元与其它细胞在遗传信息方面是相似的，因此我们有理由认为其它器官的适度应激可对脑提供保护作用。为证实这一设想，本研究采用全脑缺血模型，首先观察肢体缺血预处理（limb ischemic preconditioning, LIP）对脑缺血再灌注损伤的影响，并在此基础上从一氧化氮、即刻早期基因、热休克蛋白、切断神经等方面探讨LIP的脑保护机制。1 LIP减轻大鼠全脑缺血再灌注引起的海马CA1区锥体神经元迟发性死亡采用四血管闭塞致全脑缺血模型，观察LIP对大鼠全脑缺血再灌注引起的海马锥体神经元迟发性死亡的影响。48只大鼠椎动脉凝闭后随机分为4组：①Sham组（n=8）：游离双侧颈总动脉，但不夹闭；②LIP组（n=8）：夹闭双侧股动脉10 min，再灌流10 min，反复3次；③脑缺血组（n=8）：夹闭双侧颈总动脉8 min致全脑缺血；④LIP+脑缺血组（n=8）：LIP后行8 min全脑缺血，根据LIP与脑缺血间隔时间不同分为即刻、1 d和2 d组（n=8）。所有大鼠在sham手术或末次缺血再灌后7天，断头取脑，硫堇染色，在光学显微镜下观察海马组织形态，并对其组织学改变进行分级（0级：无神经元死亡；1级：散在的神经元死亡；2级：成片的神经元死亡；3级：几乎全部的神经元死亡），取双侧平均等级作为统计值。高倍镜下计数海马CA1区每1mm区段内细胞膜完整、胞核饱满、核仁清晰的锥体细胞数目，每张切片双侧海马各计数7个区段，取平均数为神经元密度（neuronal density, ND）。 <WP=5>结果显示，四血管闭塞全脑缺血期间，大鼠瞳孔散大，脑电波频率变慢，波幅逐渐缩小甚至呈等电位线，翻正反射消失，证明产生脑缺血。硫堇染色显示，sham组和肢体缺血组大鼠海马CA1区无明显损伤，组织学分级（histological grade，HG）为0～1级，ND分别为221±12（cells/mm，下同）、219±19。脑缺血组大鼠海马CA1区有明显组织损伤，HG为2~3级，ND为25±10，与sham组和肢体缺血组相比，HG明显升高，ND明显减少（p<0.01）。在LIP+脑缺血组，LIP后即刻脑缺血再灌注，CA1区无明显细胞缺失，HG为0～1级，ND为183±20，与脑缺血组相比，HG明显降低，ND明显升高（p<0.01）。LIP后 1 d和2 d进行脑缺血再灌注，大鼠海马CA1区锥体细胞缺失较多，有明显的组织损伤，HG均为2~3级，ND分别为42±11、41±13，与脑缺血组比较，HG有一定程度降低，ND有一定程度升高，但统计学上无显著差异(p>0.05)。表明LIP明显抑制即刻脑缺血再灌注海马CA1区锥体神经元的缺失，对1 d和2 d后脑缺血再灌注损伤虽有一定的抑制作用，但作用强度明显减弱，提示LIP对即刻发生的脑缺血再灌注损伤有明显的对抗作用。以上结果表明：①LIP本身对脑无明显损伤作用，但可对其后较短时间内发生的脑缺血再灌注损伤产生显著的对抗作用；②LIP减轻脑缺血再灌注损伤的作用以早期作用最强大，1 d和2 d时作用明显减弱。2 LIP减轻大鼠全脑缺血再灌注诱导的海马CA1区锥体神经元凋亡采用DNA 凝胶电泳、TUNEL和吖啶橙/溴乙锭（acridine orange and ethidium bromide，AO/EB）双染技术从生化和形态方面，探讨LIP对大鼠全脑缺血再灌注后海马CA1区锥体细胞凋亡的影响。76只大鼠椎动脉凝闭后分为以下4组: ①sham组（n=19）：游离双侧颈总动脉，但不夹闭；②LIP组（n=19）：夹闭双侧股动脉10 min，再灌流10 min，反复3次；③脑缺血组（n=19）：夹闭双侧颈总动脉8 min致全脑缺血；④LIP+脑缺血组（n=19）：LIP后即刻行8 min全脑缺血。大鼠于sham手术或末次缺血再灌后3天取材。凝胶电泳显示脑缺血组出现了凋亡特征性DNA梯状条带，而LIP+脑缺血组与sham组和LIP组则无上述典型梯状条带出现。TUNEL染色显示，sham组和LIP组偶有TUNEL阳性细胞，阳性细胞数分别为3.7±3.0（cells/mm， 下同）、6.0±4.0。脑缺血组可见CA1区大量具有棕黄色<WP=6>着色的TUNEL阳性细胞（69.8±12.0），与LIP组相比TUNEL阳性细胞明显增加（P<0.01）。 LIP+脑缺血组TUNEL阳性神经元数为17.8±5.8，与脑缺血组相比明显减少。AO/EB染色显示sham组和LIP组海马细胞的凋亡率分别为1.2±0.2% and 2.1±0.2%。脑缺血组海马细胞凋亡率（20.3±2.4%）较sham组和LIP组显著升高（P<0.01）。与脑缺血组比较，LIP+脑缺血组的凋亡率数值(9.1±3.8%)明显降低。以上结果提示：①8 min全脑缺血引起海马CA1区锥体神经元凋亡；②LIP可减轻全脑缺血再灌注引起的海马CA1锥体神经元的凋亡。3 一氧化氮（NO）参与LIP对脑的保护作用3.1 LIP后血清和海马组织NO生成的变化为探讨NO在LIP减轻脑缺血再灌注损伤中的作用, 观察LIP后不同时间点血清和海马组织NO生成的变化，以及应用NOS抑制剂L-NAME对LIP引起