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随着工业化和城市化的加快,海洋水体富营养化程度日益加重,赤潮发生的频率逐年升高,范围不断扩大,对人类健康、水产养殖和海洋生态系统造成严重的威胁。利用海洋溶藻细菌以达到防治赤潮的目的,可以避免传统物理和化学方法存在的诸多缺陷,具有更加广阔的应用前景。 本研究以中国东海浙江沿海赤潮多发区分离获得一株对东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)具有高效溶藻作用的细菌Halomona Sp.DH-e为出发菌株。通过对溶藻菌处理后东海原甲藻的细胞结构、正常生理功能及菌群结构等方面进行研究与分析,阐述溶藻菌抑制作用机制;并对溶藻菌Halomona Sp.DH-e发酵条件进行优化、溶藻活性物质特性及无菌滤液的生物急性毒性开展初步探索,结果如下: (1)溶藻菌Halomona Sp.DH-e通过产生胞外活性物质间接作用于东海原甲藻,溶藻效应呈现作用浓度和时间依赖性;不同生长阶段下溶藻菌的无菌滤液溶藻活性随着细菌数目的增加而逐渐升高。 (2)溶藻菌Halomona Sp.DH-e无菌滤液能够诱导东海原甲藻出现一系列形态学的改变,破坏藻细胞膜的完整性;随着作用时间推移,藻细胞发生了不同程度的脱壳现象,变形,褶皱破裂,藻细胞的内含物会大量释放到胞外,最终导致细胞结构破坏。 (3)溶藻菌Halomona Sp.DH-e无菌滤液能够显著改变藻细胞内活性氧水平,导致活性氧含量迅速积累,而伴随着藻细胞抗氧化系统启动,使细胞内MDA含量增加及抗氧化酶(SOD,CAT)活性增强以应对藻细胞的进一步损伤;并对藻细胞内大分子物质造成影响,降低藻细胞的叶绿素a含量与可溶性蛋白含量,藻细胞正常生理功能受到严重影响。 (4)基于MiSeq高通量测序技术对溶藻菌Halomona Sp.DH-e无菌滤液作用下东海原甲藻菌群结构进行分析发现,优势微生物菌群均是由Marivita属、未分类的红杆菌科细菌和Owenweeksia属构成;运用LEfSe软件检测具有显著丰度差异特征的类群发现,实验组中交替单胞菌属等出现显著性的高丰度。 (5)溶藻菌Halomona Sp.DH-e分泌的胞外溶藻活性物质具有耐高低温、强酸碱的特性及极性适中,属于非蛋白核酸类物质且分子量小于2kDa类物质。 (6)利用生物急性毒性实验发现,96h内溶藻菌Halomona Sp.DH-e无菌滤液对斑马鱼的半致死浓度LC50>100mg/L;在最大剂量5000mg/kg·bw下小鼠14d的死亡率为0%,半致死剂量LD50>5000mg/kg·bw,属低毒物质。并根据急性毒性试验结果,初步判断溶藻菌Halomona Sp.DH-e无菌滤液不会对周围生物造成毒性危害。 (7)对溶藻菌Halomona Sp.DH-e进行发酵条件优化,获得最佳工艺条件为:摇床温度28℃,培养基初始pH9.0,培养时间6d,摇床转速120rpm。