论文部分内容阅读
第一部分阿托伐他汀对液压冲击脑损伤后内质网应激诱导神经细胞凋亡的影响目的:观察阿托伐他汀对大鼠液压冲击脑损伤后抗内质网应激凋亡的神经细胞保护作用。方法:健康成年SD大鼠32只(购于河北医科大学动物中心),体重250g左右,采用液压冲击方法制作脑损伤模型。将大鼠随机分为4组:假手术组(Sham组)、脑损伤组(TBI组)、Vehicle组(TBI+Vehicle组)、阿托伐他汀干预组(Atorv组),每组8只。Sham组只进行头颅开骨窗,不行液压冲击;TBI组只进行液压冲击;Vehicle组头颅开骨窗,制作液压冲击,并给予等体积生理盐水;Atorv组进行液压冲击,并给予10 mg/kg阿托伐他汀。将阿托伐他汀溶于生理盐水中,于术前3天开始灌胃给药,每天1次,直至取材。各组大鼠在造模成功后24小时进行神经功能缺损评分(mNSS),其后过度麻醉处死,冰板上快速留取脑组织,选取损伤区前缘约100 mg脑组织标本以干湿重法测量脑组织含水量;去除挫伤区完全破碎的脑组织,冠状切取挫伤灶范围内的半暗带脑皮质,迅速液氮冷冻,然后存储于-80℃冰箱,其后用于免疫蛋白印迹(Western Blot)检测脑组织细胞中GRP78、Caspase3蛋白。结果:1.神经功能缺损评分(mNSS)进行液压冲击的各组大鼠在24小时后出现明显神经功能缺损症状,主要表现为心率增快、呼吸不规则、四肢肌张力增高,向偏瘫侧歪斜等。Sham组大鼠无明显神经功能缺损症状。与Sham组相比,TBI组神经功能缺损症状明显增多(P<0.05);TBI组与Vehicle组之间大鼠神经功能缺损症状差异不明显(P>0.05);Atorv组大鼠神经功能缺损症状低于TBI组(P<0.05)。2.脑组织含水量检测与Sham组相比,TBI组大鼠脑组织含水量明显升高(P<0.05);TBI组与Vehicle组之间大鼠脑组织含水量无明显差异(P>0.05);Atorv组大鼠脑组织含水量低于TBI组(P<0.05)。3.Western Blot检测GRP78、Caspase3:与Sham组相比,TBI组大鼠GRP78、Caspase3蛋白表达明显增多(P<0.05);TBI组与Vehicle组之间GRP78、Caspase3蛋白表达无明显差异(P>0.05);Atorv组GRP78、Caspase3蛋白表达低于TBI组(P<0.05)。结论:1.对大鼠进行液压冲击脑损伤后,内质网应激标志性蛋白GRP78和凋亡相关蛋白Caspase3含量显著升高,神经功能缺损症状明显加重,脑组织含水量显著增多,说明液压冲击脑损伤后出现内质网应激,并诱导神经细胞凋亡。2.液压冲击脑损伤后,阿托伐他汀可以对内质网应激诱导的神经细胞凋亡起到保护作用。第二部分阿托伐他汀发挥抗内质网应激神经细胞凋亡作用的机制研究目的:测定给予阿托伐他汀后液压冲击脑损伤各组大鼠神经功能评分、脑组织含水量、Nrf2及内质网应激凋亡通路标志蛋白表达水平,研究阿托伐他汀发挥抗内质网应激凋亡作用的机制。方法:健康成年SD大鼠32只,体重250g左右,采用液压冲击方法制作脑损伤模型。将大鼠随机分为4组:假手术组(Sham组)、脑损伤组(TBI组)、Vehicle组(TBI+Vehicle组)、阿托伐他汀干预组(Atorv组),每组8只。各组大鼠在造模成功后24小时进行神经功能缺损评分(mNSS),其后过度麻醉处死,冰板上快速留取脑组织,选取损伤区前缘约100 mg脑组织标本以干湿重法测量脑组织含水量;去除挫伤区完全破碎的脑组织,冠状切取挫伤灶范围内的半暗带脑皮质分成两份,一份迅速液氮冷冻,然后存储于-80℃冰箱,其后用于免疫蛋白印迹(Western Blot)检测脑组织细胞中GRP78、P-PERK、P-eif2α、ATF6、P-IRE1α、P-JNK、CHOP、Caspase3、Caspase12、Nrf2核蛋白及胞浆蛋白。另一份即刻行流式细胞学检测。结果:1.神经功能评分进行液压冲击的各组大鼠在24小时后出现明显神经功能缺损症状,主要表现为心率增快、呼吸不规则、四肢肌张力增高,向偏瘫侧歪斜等。Sham组大鼠无明显神经功能缺损症状。与Sham组相比,TBI组神经功能缺损症状明显增多(P<0.05);TBI组与Vehicle组之间大鼠神经功能缺损症状差异不明显(P>0.05);Atorv组大鼠神经功能缺损症状低于TBI组(P<0.05)。2.脑组织含水量测定与Sham组相比,TBI组大鼠脑组织含水量明显升高(P<0.05);TBI组与Vehicle组之间大鼠脑组织含水量无明显差异(P>0.05);Atorv组大鼠脑组织含水量低于TBI组(P<0.05)。3.流式细胞学检测神经细胞凋亡与Sham组相比,TBI组大鼠神经细胞早期凋亡率明显升高(P<0.05);TBI组与Vehicle组之间大鼠神经细胞早期凋亡率无明显差异(P>0.05);Atorv组大鼠神经细胞早期凋亡率低于TBI组(P<0.05)。4.Western Blot检测GRP78、P-PERK、P-eif2α:与Sham组相比,TBI组大鼠GRP78、P-PERK、P-eif2α蛋白表达明显增多(P<0.05);TBI组与Vehicle组之间GRP78、P-PERK、P-eif2α蛋白表达无明显差异(P>0.05);Atorv组GRP78、P-PERK、P-eif2α蛋白表达低于TBI组(P<0.05)。P-IRE1α、P-JNK:与Sham组相比,TBI组P-IRE1α、P-JNK蛋白表达明显增多(P<0.05);TBI组与Vehicle组之间P-IRE1α、P-JNK蛋白表达无明显差异(P>0.05);Atorv组与TBI组之间P-IRE1α、P-JNK蛋白表达无明显差异(P>0.05)。ATF6、Caspase12、CHOP、Caspase3:与Sham组相比,TBI组大鼠ATF6、Caspase12、CHOP、Caspase3蛋白表达明显增多(P<0.05);TBI组与Vehicle组之间ATF6、Caspase12、CHOP、Caspase3蛋白表达无明显差异(P>0.05);Atorv组ATF6、Caspase12、CHOP、Caspase3蛋白表达低于TBI组(P<0.05)。Nrf2:与Sham组比较,TBI组Nrf2胞核蛋白表达显著增高(P<0.05);TBI组与Vehicle组之间Nrf2胞核蛋白表达无明显差异(P>0.05);Atorv组Nrf2胞核蛋白表达高于TBI组(P<0.05)。与Sham组比较,TBI组Nrf2胞浆蛋白表达显降低(P<0.05);TBI组与Vehicle组之间Nrf2胞浆蛋白表达无明显差异(P>0.05);Atorv组Nrf2胞浆蛋白表达低于TBI组(P<0.05)。结论:1.阿托伐他汀干预后可以提高Nrf2的活性。2.液压冲击脑损伤后,阿托伐他汀可以通过抑制PERK、ATF6、Caspase12凋亡通路的相关蛋白的表达,对神经细胞起到保护作用,而与IRE1通路无关。第三部分阿托伐他汀上调Nrf2表达抑制内质网应激诱导神经细胞凋亡的机制研究目的:通过测定各组小鼠神经功能评分、脑组织含水量、Nrf2及各凋亡通路标志蛋白表达水平,观察Nrf2是否参与了阿托伐他汀对液压冲击脑损伤后小鼠的抗凋亡作用并探究其机制。方法:本实验采用8～12周龄雄性ICR种系Nrf2基因敲除纯合子Nrf2(-/-)型(由河北医科大学第二医院河北省神经科学重点实验室惠赠)和野生型纯合子Nrf2(+/+)型小鼠通过液压冲击法建立脑损伤模型。饲养于河北医科大学第二医院动物中心22～25°C和50～70%湿度环境下,采用近交系繁殖,12小时光/暗循环,自由进食水。选取体重30±2克雄性小鼠,Nrf2(-/-)型及Nrf2(+/+)型各16只,分别随机分为2组:TBI+Vehicle组(Vehicle组)8只,TBI+Atorv组(Atorv组)8只。在造模成功后24小时进行神经功能缺损评分,其后过度麻醉处死,冰板上快速留取脑组织,选取损伤区前缘约100 mg脑组织标本以干湿重法测量脑组织含水量;去除挫伤区完全破碎的脑组织,冠状切取挫伤灶范围内的半暗带脑皮质分成两份,一份迅速液氮冷冻,然后存储于-80℃冰箱,其后用于免疫蛋白印迹(Western Blot)检测脑组织细胞中GRP78、P-PERK、P-eif2α、ATF6、Caspase12、CHOP、Caspase3、Nrf2核蛋白及胞浆蛋白。另一份即刻行流式细胞学检测。结果:1.神经功能评分各组小鼠在24小时后均出现明显神经功能缺损症状,主要表现为心率增快、呼吸不规则、四肢肌张力增高,向偏瘫侧歪斜等。Atorv组Nrf2(+/+)型小鼠神经功能缺损症状明显轻于其余各组,差异有统计学意义(P<0.05);Atorv组Nrf2(-/-)型小鼠较Vehicle组Nrf2(-/-)型小鼠降低(P<0.05),但高于Atorv组Nrf2(+/+)型小鼠,差异有统计学意义(P<0.05)。2.脑组织含水量测定Atorv组Nrf2(+/+)型小鼠脑组织含水量明显少于其余各组,差异有统计学意义(P<0.05);Atorv组Nrf2(-/-)型小鼠脑组织含水量较Vehicle组Nrf2(-/-)型小鼠降低(P<0.05),但高于Atorv组Nrf2(+/+)型小鼠,差异有统计学意义(P<0.05)。3.流式细胞学检测Atorv组Nrf2(+/+)型小鼠神经细胞早期凋亡率明显低于其余各组,差异有统计学意义(P<0.05);Atorv组Nrf2(-/-)型小鼠神经细胞早期凋亡率较Vehicle组Nrf2(-/-)型降低(P<0.05),但高于Atorv组Nrf2(+/+)型小鼠,差异有统计学意义(P<0.05)。4.Western Blot检测Nrf2:脑损伤后24小时,Atorv组Nrf2(+/+)型小鼠Nrf2核蛋白表达高于Vehicle组Nrf2(+/+)型小鼠(P<0.05);与之相反,Atorv组Nrf2(+/+)型小鼠Nrf2胞浆蛋白表达低于Vehicle组Nrf2(+/+)型小鼠(P<0.05);Nrf2(-/-)小鼠各组无明显Nrf2表达。GRP78、P-PERK、P-eif2α:Atorv组Nrf2(+/+)型小鼠GRP78、P-PERK、P-eif2α蛋白含量明显低于其余各组,差异有统计学意义(P<0.05);Atorv组Nrf2(-/-)型小鼠GRP78、P-PERK、P-eif2α蛋白含量较Vehicle组Nrf2(-/-)型小鼠降低(P<0.05),但高于Atorv组Nrf2(+/+)型小鼠,差异有统计学意义(P<0.05)。ATF6、Caspase12、Caspase3、CHOP:Atorv组Nrf2(+/+)型小鼠ATF6、Caspase12、Caspase3、CHOP蛋白含量明显低于其余各组,差异有统计学意义(P<0.05);Atorv组Nrf2(-/-)型小鼠ATF6、Caspase12、Caspase3、CHOP蛋白含量较Vehicle组Nrf2(-/-)型小鼠降低(P<0.05),但高于Atorv组Nrf2(+/+)型小鼠,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.液压冲击脑损伤后,Nrf2具有脑保护作用,可以抑制内质网应激性神经细胞凋亡。2.阿托伐他汀可以通过上调Nrf2活性,从而抑制PERK、ATF6、Caspase12凋亡通路相关蛋白的表达,对神经细胞起到保护作用。