肿瘤严重威胁公众健康，是世界范围内威胁导致死亡的主要原因。虽然对于癌症发生机理的研究已取得极大的进展，但若想彻底治疗癌症仍有很长的一段路要走。　　 蛋白质等生物大分子在许多疾病的发生和治疗中发挥着重要作用，但是根据类药五规则[1]，通常认为蛋白质类药物具有很差的渗透性。使得蛋白质这类有治疗价值但无细胞膜穿透性且易降解的亲水性分子在细胞生物学、药学等研究领域中的应用大大受到限制。长久以来研究人员致力于探索将这些效应分子导入活细胞的有效方法。常用的方法有:物理方法，如电穿孔[2]、显微注射[3]等;生物及化学方法，如洋地黄皂苷处理法[4]、成孔蛋白质法[5]等;其他方法，如运用免疫毒素等蛋白质载体[6]、颗粒（如脂质体）包裹法[7]和病毒载体[8]等。尽管这些方法各有优势，但都存在分子导入率低、易造成细胞损伤甚至死亡、操作复杂和难于调控等问题。　　 细胞穿膜肽(cell pnentrating peptides，CPPs)又称蛋白转导域(protein transductingdomain)、特洛伊肽(Trojan peptides)。通常含有5-30个氨基酸，与其他多肽不同的是，细胞穿膜肽可以通过无细胞特异性、受体介导自由地导入各种哺乳动物细胞内部，且不会造成细胞损伤。细胞穿膜肽的发现为生物大分子用于疾病治疗带来了曙光，在细胞生物学、药物体内转运、临床药效评价及细胞免疫学等研究领域均具有良好的应用前景。目前公认以细胞穿膜肽多聚精氨酸最为简单有效。　　 胞嘧啶脱氨酶(Cytosine Deaminase，CD)是自杀基因肿瘤治疗中的典型代表。胞嘧啶脱氨酶可转化无细胞毒性的前导药物5氟胞嘧啶(5-fluorocytosine，5-FC)为化疗药物5氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）。5氟尿嘧啶可通过抑制胸苷酸合成酶的活性阻断DNA的复制继而引起细胞凋亡。　　 本研究所用胞嘧啶脱氨酶，为来源于大肠杆菌的原核胞嘧啶脱氨酶及其突变体。此突变体在天然的原核胞嘧啶脱氨酶的第316位苯丙氨酸和第317为天冬氦酸突变为半胱氨酸和甘氨酸。突变后的原核胞嘧啶脱氨酶可显著提高对5氟胞嘧啶的转化效率，表现出更强的抑癌作用。　　 本实验在原pSUMO载体的基础上构建pSUMO-R9-EGFP，将构建好的载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，经IPTG诱导后通过SDS-PAGE比较SUMO-EGFP及SUMO-R9-EGFP表达量及可溶性的差异。用Ni-NTA亲和层析柱纯化SUMO-R9-EGFP，并利用SUMOprotease I切去SUMO标签，最终获得纯度较高的R9-EGFP成熟蛋白。以HepG2细胞为靶细胞，以EGFP为对照，利用流式细胞仪及激光共聚焦检测R9-EGFP的穿膜效果，结果显示获得的成熟R9-EGFP可快速进入细胞内部，并聚集于细胞核内，而EGFP无此功能。同时R9-EGFP的穿膜效率呈时间、剂量依赖性，可被肝素抑制。　　 在pSUMO-R9-EGFP质粒EGFP的位置插入原核胞嘧啶脱氨酶及其突变体，成功表达并纯化多聚精氨酸-原核胞嘧啶脱氨酶及多聚精氨酸-原核胞嘧啶脱氨酶突变体等融合蛋白。以HepG2细胞及U251细胞为靶细胞，以单独原核胞嘧啶脱氨酶为对照，利用MTT比色法检测两种融合蛋白的细胞毒活性。结果显示两种融合蛋白均具有细胞毒性，且突变体优于天然的原核胞嘧啶脱氨酶，单独原核胞嘧啶脱氨酶无明显细胞毒性，差异极显著。　　 以小鼠肝癌细胞H22为肿瘤动物模型，皮下注射多聚精氨酸-原核胞嘧啶脱氨酶及多聚精氨酸-原核胞嘧啶脱氨酶突变体等融合蛋白，腹部注射5氟胞嘧啶进行治疗。结果显示两种融合蛋白均具有抗肿瘤活性，与未治疗组和单独胞嘧啶脱氨酶治疗组相比，融合蛋白治疗组可延长肿瘤小鼠存活时间8-10天。经病理切片观测，经多聚精氨酸-原核胞嘧啶脱氨酶及多聚精氨酸-原核胞嘧啶脱氨酶突变体治疗后的肿瘤组织较对照组坏死严重。