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新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)为单股、负链、不分节段且有囊膜的RNA病毒。作为危害全球养禽业最为严重的病原之一，强毒NDV几乎能够感染所有的禽类并引起以急性、热性和败血性为特征的新城疫(Newcastle disease，ND)。MicroRNA(miRNA)是一类在真核生物中广泛存在，且具有较高保守性的非编码小RNA。已有研究表明，miRNA几乎在细胞生长发育的所有过程中都发挥着重要的调控作用。此外，越来越多的研究表明miRNA也可以通过靶向结合病毒基因组或调节宿主细胞的抗病毒反应，从而调控病毒在宿主细胞中的感染、复制和致病性。然而，目前人们对miRNA在NDV感染宿主细胞过程中的功能以及具体功能机制仍然知之甚少。本研究运用生物信息学分析方法和分子生物学技术，对鸡胚成纤维细胞系DF-1细胞中调控NDV复制的miRNA进行鉴定并对其调控机制进行研究，为进一步阐明miRNA在NDV感染宿主过程中的功能奠定基础。
1．靶向结合NDV基因组miRNA的筛选和功能研究
为探讨是否存在靶向结合NDV基因组的禽源miRNA，利用RegRNA2.0软件对不同亚型NDV基因组靶miRNA进行预测，并对预测所得miRNA的结合位点在不同NDV毒株间的保守性进行分析；结果显示11条miRNAs可能广谱靶向不同亚型NDV基因组。将NDV各基因序列野生型或miRNA结合位点突变型报告质粒与相应miRNA模拟物或抑制剂或阴性对照共转染DF-1细胞后通过双荧光素酶实验检测靶miRNA与NDV基因组互作关系：结果显示，gga-miR-1603和gga-miR-1794负调控L基因野生型报告质粒的双荧光素酶活性，但对miRNA结合位点突变型报告质粒的双荧光素酶活性没有影响，表明gga-miR-1603和gga-miR-1794可以靶向结合NDV L基因；通过实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR，qPCR)和Western blotting验证这两条miRNAs与NDV L基因表达关系，结果显示gga-miR-1603和gga-miR-1794在RNA和蛋白水平负调控L基因的表达，表明这两条miRNAs结合NDV L基因后抑制L基因的翻译并诱导其降解；通过检测细胞上清中的病毒含量，我们发现在DF-1细胞中过表达这两条miRNA显著性抑制了NDV的复制，相反敲低这两条miRNAs则促进了NDV的复制，表明gga-miR-1603和gga-miR-1794可以负调控NDV在DF-1细胞中的复制。综上所述，gga-miR-1603和gga-miR-1794可以靶向结合NDV L基因，通过抑制L基因的翻译和诱导L基因的降解，从而抑制NDV的复制。
2．NDV感染DF-1细胞后miRNA表达谱分析及差异表达miRNA功能研究
为进一步探究miRNA在NDV复制过程中的功能，以NDV感染和未感染的DF-1细胞为对象，利用高通量测序技术测定细胞miRNA表达谱的变化，数据分析结果显示与未感染NDV组（空白组）相比，NDV感染6h组(NDV-6h)和NDV感染12h组(NDV-12h)中分别有73条和64条显著性差异表达(Significantly differentially expressed,SDE)miRNAs，其中49条SDE miRNAs在两个比较组中表达模式相同；随机选择了15条SDE miRNAs，通过qPCR对其表达模式进行验证，结果显示NDV感染DF-1细胞后gga-miR-130a-5p和gga-miR-1434的表达显著性下调，而gga-miR-199-5p、gga-miR-301a-3p、gga-miR-451、gga-miR-1451-3p、gga-miR-29a-3p、gga-miR-130a-3p、gga-miR-181a-5p、gga-miR-140-5p、gga-miR-17-5p、gga-miR-107-3p、gga-miR-33-5p、gga-miR-19b-3p和gga-miR-18a-5p表达则显著性上调，qPCR结果与高通量测序结果基本一致，表明测序程序和数据分析方法准确度较高。
为进一步探讨SDE miRNA的生物学功能，利用miRNA模拟物和抑制剂分别过表达或敲低相应的miRNA，通过qPCR、Western blotting和ELISA方法检测其对NDV复制和诱导炎症反应的影响，结果显示gga-miR-451和gga-miR-199-5p正调控NDV的复制，相反gga-miR-19b-3p和gga-miR-29a-3p负调控NDV的复制，同时gga-miR-451负调控NDV诱导的炎症因子的表达。生物信息学预测和双荧光素酶实验验证结果显示gga-miR-451负调控YWHAZ(Tyr-3/Trp-5monooxygenase activation protein zeta)3非编码区野生型质粒的双荧光素酶活性，但对结合位点突变型质粒双荧光素酶活性没影响；此外，qPCR和Western blotting结果显示gga-miR-451在RNA和蛋白水平负调控DF-1细胞中YWHAZ的表达；综上表明，在DF-1细胞中YWHAZ为gga-miR-451的靶基因。
利用小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)敲低DF-1细胞中YWHAZ的表达并通过qPCR检测NDV感染后细胞中炎症因子和NP基因的水平，结果显示敲低YWHAZ抑制了炎症因子水平并提高了病毒NP基因的含量，而这些表型与过表达gga-miR-451一致，表明在DF-1细胞中gga-miR-451通过靶向结合YWHAZ抑制NDV感染诱导的炎症反应，最终促进NDV的复制。综上所述，本章测定并分析了NDV感染DF-1细胞后miRNA的表达谱，并鉴定出15条SDE miRNAs和4条调控NDV复制的miRNAs，同时初步探究了gga-miR-451调控NDV复制的分子机制，为进一步研究miRNA在NDV感染和复制过程中的功能提供理论依据。
3．gga-miR-19b-3p调控NDV复制的分子机制研究
基于本研究已有结果，继续探讨gga-miR-19b-3p调控NDV复制的分子机制。通过TargetScan和miRDB数据库预测gga-miR-19b-3p可能的靶基因并利用DAVID数据库对靶基因功能进行注释，结果显示靶基因中ZMYND11(Zinc finger MYNDdomain-containing protein11)和RNF11(Ring finger protein11)可能参与调控宿主免疫反应；通过双荧光素酶实验验证ZMYND11和RNF11与gga-miR-19b-3p互作关系，结果显示gga-miR-19b-3p抑制了含ZMYND11和RNF113’非编码区报告质粒的双荧光素酶活性，但对结合位点突变型质粒的双荧光素酶活性没有影响；同时qPCR和Westernblotting结果显示gga-miR-19b-3p负调控ZMYND11和RNF11的表达，综上表明在DF-1细胞中ZMYND11和RNF11为gga-miR-19b-3p的靶基因。
进一步探究ZMYND11和RNF11的功能，我们发现ZMYND11和RNF11正调控NDV的复制，同时负调控NDV诱导的炎性因子的表达，而这些表型与gga-miR-19b-3p相反，表明gga-miR-19b-3p通过靶向结合ZMYND11和RNF11促进NDV诱导的炎症反应并抑制NDV复制。此外，我们发现RNF11和ZMYND11抑制了NDV感染后细胞核转录因子kappa B(Nuclear factor kB，NF-kB)的活性，促进了NF-kB抑制因子α(Inhibitor of NF-kB，IkB-α)的磷酸化和降解，同时抑制了p65亚基的核转运，表明在DF-1细胞中RNF11和ZMYND11通过负调控NF-kB的激活从而抑制NDV诱导的炎症反应。综上结果表明，NDV感染DF-1细胞后能够诱导gga-miR-19b-3p的表达上调，而上调表达的gga-miR-19b-3p通过靶向作用于RNF11和ZMYND11促进NF-kB的激活和随后的炎症反应，最终抑制了NDV的复制。
1．靶向结合NDV基因组miRNA的筛选和功能研究
为探讨是否存在靶向结合NDV基因组的禽源miRNA，利用RegRNA2.0软件对不同亚型NDV基因组靶miRNA进行预测，并对预测所得miRNA的结合位点在不同NDV毒株间的保守性进行分析；结果显示11条miRNAs可能广谱靶向不同亚型NDV基因组。将NDV各基因序列野生型或miRNA结合位点突变型报告质粒与相应miRNA模拟物或抑制剂或阴性对照共转染DF-1细胞后通过双荧光素酶实验检测靶miRNA与NDV基因组互作关系：结果显示，gga-miR-1603和gga-miR-1794负调控L基因野生型报告质粒的双荧光素酶活性，但对miRNA结合位点突变型报告质粒的双荧光素酶活性没有影响，表明gga-miR-1603和gga-miR-1794可以靶向结合NDV L基因；通过实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR，qPCR)和Western blotting验证这两条miRNAs与NDV L基因表达关系，结果显示gga-miR-1603和gga-miR-1794在RNA和蛋白水平负调控L基因的表达，表明这两条miRNAs结合NDV L基因后抑制L基因的翻译并诱导其降解；通过检测细胞上清中的病毒含量，我们发现在DF-1细胞中过表达这两条miRNA显著性抑制了NDV的复制，相反敲低这两条miRNAs则促进了NDV的复制，表明gga-miR-1603和gga-miR-1794可以负调控NDV在DF-1细胞中的复制。综上所述，gga-miR-1603和gga-miR-1794可以靶向结合NDV L基因，通过抑制L基因的翻译和诱导L基因的降解，从而抑制NDV的复制。
2．NDV感染DF-1细胞后miRNA表达谱分析及差异表达miRNA功能研究
为进一步探究miRNA在NDV复制过程中的功能，以NDV感染和未感染的DF-1细胞为对象，利用高通量测序技术测定细胞miRNA表达谱的变化，数据分析结果显示与未感染NDV组（空白组）相比，NDV感染6h组(NDV-6h)和NDV感染12h组(NDV-12h)中分别有73条和64条显著性差异表达(Significantly differentially expressed,SDE)miRNAs，其中49条SDE miRNAs在两个比较组中表达模式相同；随机选择了15条SDE miRNAs，通过qPCR对其表达模式进行验证，结果显示NDV感染DF-1细胞后gga-miR-130a-5p和gga-miR-1434的表达显著性下调，而gga-miR-199-5p、gga-miR-301a-3p、gga-miR-451、gga-miR-1451-3p、gga-miR-29a-3p、gga-miR-130a-3p、gga-miR-181a-5p、gga-miR-140-5p、gga-miR-17-5p、gga-miR-107-3p、gga-miR-33-5p、gga-miR-19b-3p和gga-miR-18a-5p表达则显著性上调，qPCR结果与高通量测序结果基本一致，表明测序程序和数据分析方法准确度较高。
为进一步探讨SDE miRNA的生物学功能，利用miRNA模拟物和抑制剂分别过表达或敲低相应的miRNA，通过qPCR、Western blotting和ELISA方法检测其对NDV复制和诱导炎症反应的影响，结果显示gga-miR-451和gga-miR-199-5p正调控NDV的复制，相反gga-miR-19b-3p和gga-miR-29a-3p负调控NDV的复制，同时gga-miR-451负调控NDV诱导的炎症因子的表达。生物信息学预测和双荧光素酶实验验证结果显示gga-miR-451负调控YWHAZ(Tyr-3/Trp-5monooxygenase activation protein zeta)3非编码区野生型质粒的双荧光素酶活性，但对结合位点突变型质粒双荧光素酶活性没影响；此外，qPCR和Western blotting结果显示gga-miR-451在RNA和蛋白水平负调控DF-1细胞中YWHAZ的表达；综上表明，在DF-1细胞中YWHAZ为gga-miR-451的靶基因。
利用小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)敲低DF-1细胞中YWHAZ的表达并通过qPCR检测NDV感染后细胞中炎症因子和NP基因的水平，结果显示敲低YWHAZ抑制了炎症因子水平并提高了病毒NP基因的含量，而这些表型与过表达gga-miR-451一致，表明在DF-1细胞中gga-miR-451通过靶向结合YWHAZ抑制NDV感染诱导的炎症反应，最终促进NDV的复制。综上所述，本章测定并分析了NDV感染DF-1细胞后miRNA的表达谱，并鉴定出15条SDE miRNAs和4条调控NDV复制的miRNAs，同时初步探究了gga-miR-451调控NDV复制的分子机制，为进一步研究miRNA在NDV感染和复制过程中的功能提供理论依据。
3．gga-miR-19b-3p调控NDV复制的分子机制研究
基于本研究已有结果，继续探讨gga-miR-19b-3p调控NDV复制的分子机制。通过TargetScan和miRDB数据库预测gga-miR-19b-3p可能的靶基因并利用DAVID数据库对靶基因功能进行注释，结果显示靶基因中ZMYND11(Zinc finger MYNDdomain-containing protein11)和RNF11(Ring finger protein11)可能参与调控宿主免疫反应；通过双荧光素酶实验验证ZMYND11和RNF11与gga-miR-19b-3p互作关系，结果显示gga-miR-19b-3p抑制了含ZMYND11和RNF113’非编码区报告质粒的双荧光素酶活性，但对结合位点突变型质粒的双荧光素酶活性没有影响；同时qPCR和Westernblotting结果显示gga-miR-19b-3p负调控ZMYND11和RNF11的表达，综上表明在DF-1细胞中ZMYND11和RNF11为gga-miR-19b-3p的靶基因。
进一步探究ZMYND11和RNF11的功能，我们发现ZMYND11和RNF11正调控NDV的复制，同时负调控NDV诱导的炎性因子的表达，而这些表型与gga-miR-19b-3p相反，表明gga-miR-19b-3p通过靶向结合ZMYND11和RNF11促进NDV诱导的炎症反应并抑制NDV复制。此外，我们发现RNF11和ZMYND11抑制了NDV感染后细胞核转录因子kappa B(Nuclear factor kB，NF-kB)的活性，促进了NF-kB抑制因子α(Inhibitor of NF-kB，IkB-α)的磷酸化和降解，同时抑制了p65亚基的核转运，表明在DF-1细胞中RNF11和ZMYND11通过负调控NF-kB的激活从而抑制NDV诱导的炎症反应。综上结果表明，NDV感染DF-1细胞后能够诱导gga-miR-19b-3p的表达上调，而上调表达的gga-miR-19b-3p通过靶向作用于RNF11和ZMYND11促进NF-kB的激活和随后的炎症反应，最终抑制了NDV的复制。