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目的 我国是地方性氟中毒发生率较高的大国，由于氟的过量摄入导致的氟骨症困扰了许多患者。目前人们对于氟的骨相损伤机制尚不完全清楚。成骨细胞作为骨组织中重要的功能细胞，在骨的形成过程中起着关键作用。 本研究目的在于建立体外大鼠（乳鼠）颅骨成骨细胞分离培养体系及鉴定技术，排除体内多种调控因素的相互影响，从单细胞的形态和代谢指标的变化，观察氟化物对体外培养的成骨细胞的直接效应，探讨不同浓度氟化物对成骨细胞是否具有促进增殖和分化作用，从而在细胞水平了解氟化物对骨形成过程的作用；通过体内、外实验研究氟化物对成骨细胞结构、细胞周期和细胞凋亡的影响，为进一步探讨氟致骨骼损伤的机制提供基础资料；通过检测氟化物对成骨细胞的DNA损伤，探讨成骨细胞对氟化物的基因毒性反应，为全面评价氟毒性提供科学依据。 方法 1．大鼠颅骨成骨细胞分离培养纯化体系及鉴定技术的建立： 生后2天的Wistar乳鼠脱颈处死后，无菌取颅盖骨放入盛有缓冲液的培养皿中，尽量去除骨膜和周围结缔组织。加入0.25％胰蛋白酶液，37℃恒温消化20min。再用1mg／mlⅡ型胶原酶溶液，37℃恒温消化90min，使细胞从骨基质中解离出来。将上述含分离细胞及骨片的消化液移于离心管中离心，去上清，加入含15％胎牛血清的199培养液，反复吹打成单细胞悬液，以1×105／ml加入培养瓶，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，隔天换液。应用差速黏附法纯化成骨细胞。Ⅰ型胶原免疫组化方法鉴定成骨细胞。 2．成骨细胞增殖、分化指标的测定 成骨细胞以5×104／ml接种至96孔板，24小时后换为无血清199培养液，次日加入不同浓度（0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、4mmol／L）的氟化钠继续培养24、48、72h，采用AlamarBlue摄入法检测细胞增殖；Elisa方法测定碱性磷酸酶活性。 3．成骨细胞周期和细胞凋亡的检测 成骨细胞以 IX 10VInl接种至 25Inl培养瓶，在含 15％胎牛血清的 199培养液中培养 3天。换为无血清 199培养液，24小时后加人终浓度为门。1上J／。OU)的氟化钠，继续培养24 ／J’时。用0．25％胰酶消化各组细胞，PBS洗2次，加人配制好的PI染液37℃孵育30分钟，用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡。 4．细胞 DNA损伤检测 成骨细胞以 IX 10Vd接种于 6孔板，待细胞融合后，换为无血清 199培养液中培养 24 ／J’时。加人终浓度为 0刀．5上在＊ rnmol／L氟化钠作用 24／J’时。经胰蛋白酶消化，离心弃上清，PBS冲洗2次，计数并调整使各剂量组细胞悬液中细胞数为 1．0 X 10VInl。用单细胞凝胶电泳（营星实验）方法检测DNA损伤。 5．动物实验 雌性 Wistar大鼠 40只随机分成 4组止组门照组)大鼠饲正常饲料，饮蒸馏水出组饮用蒸馏水含氟化钠 50mg／L；C组饮用蒸馏水含氟化钠100m矿L山组饮用蒸馏水含氟化钠150m吵L。大鼠自由进食水，60天后全部雌鼠与20只雄鼠按2：二进行交配。所生仔鼠颅盖骨进行光镜、电镜观察；提取仔鼠颅骨成骨细胞，观察细胞超微结构，检测细胞周期与细胞凋亡的变化。 6．数据处理 用 EXCEL3．0进行实验数据的统计分析。 结 果 1．原代成骨细胞培养结果： 门)相差显微镜观察 分离的成骨细胞在培养24h后，活细胞贴壁生长。贴壁生长的细胞呈梭形、三角形或多角形等。成骨细胞在单层铺满培养瓶后可出现重叠生长，其中心部细胞密集并可发生钙化，形成肉眼可见的散在白色点状物。 p)I型胶原免疫组化鉴定 ·2· 成骨细胞的胞浆内和细胞间质中分布有棕黄色颗粒，为成骨细胞所分泌的1型胶原，胞核空染，为阳性结果。 2．不同浓度的氟化钠对成骨细胞增殖、分化的影响 低浓度氟化钠 （100umoU－lmmoULL 72h在体外可刺激细胞增殖；高浓度氟化钠门 以上）可抑制细胞增殖；NaF浓度10PmoUL－50pmoUL，4d增强细胞 ALP活力；100pmoUL Li上的 NaF降低了细胞 ALP活力。 3．不同浓度的氟化钠对体外培养成骨细胞细胞周期和细胞凋亡的影响 NaF浓度为0－ZmmoUL在4h对体外培养成骨细胞活性无影响。浓度Zmmol／L时S期细胞数增多，G／Gl期和G／M期细胞无明显改变。NaF浓度为3户nunoUL时，抑制了细胞的活性／期细胞数明显增多，G／M期细胞明显减少。NaF浓度为23Anunol／L时，凋亡百分率增高。 4．不同浓度的氟化钠对体外培养成骨细胞DNA的损伤作用 在相同的条件下，用 0－3。oVL的陇F作用于 OB，发现地F可不同程度的诱导 DNA链断裂。与对照组相比，0．5－InunoUL组 DNA迁移距离（尾长）虽有所增加，但差别没有显著性。2－3 nunoUL组 DNA迁移距离(尾长片对照组明显增加，差异显著。3nunol／L组营星尾长与ZmmoUL组相比也有显著性差异。 5．母鼠体内不同程度染氟对所生仔鼠颅骨成骨细胞的影响 5．l母鼠染氟对所生仔鼠颅骨成骨细胞的超微结构的影响 对照组可见