目的：　　通过体外培养猪卵巢窦状卵泡颗粒细胞(GC)，经过量雄激素刺激分别构建卵泡发育障碍的细胞模型。从细胞增殖分化与细胞周期调控角度来探讨养精种玉汤及其各主要有效部位群对模型GC的作用机制，进一步阐明养精种玉汤促卵泡发育的物质基础，明确各类有效部位作用特点，为方剂的现代研究提供思路与方法，为扩大该方应用、挖掘新的促卵泡发育的中药活性物质群提供实验依据。　　通过体外培养猪卵巢窦状卵泡，经过量雄激素诱导卵泡产生胰岛素抵抗来构建发育障碍的卵泡模型。从胰岛素抵抗作为PCOS发生发展的病理生理基础来展开探讨养精种玉汤促卵泡发育的机制，为该方临床合理应用提供实验依据。　　方法：　　1、养精种玉汤及其有效部位水溶液的制作：养精种玉汤-A(熟地黄30g、山茱萸15g、白芍15g、当归15g)及其有效部位(乙醇提取溶液-B、乙酸乙酯萃取物-C、正丁醇萃取物-D、乙醇沉淀物-E与萃取后的水层-F)由广东药学院统一制备。复方终浓度为含生药1g/ml，有效部位是从含生药1g/ml的复方中提取。　　2、猪卵巢窦状卵泡及颗粒细胞的提取：获取新鲜的猪卵巢，分离得到直径为5~8mm的卵泡；抽取部分卵泡的卵泡液，利用酶消化法联合离心法来提取颗粒细胞。　　3、卵泡发育障碍的细胞模型和卵泡模型建立：利用过量丙酸睾酮(250μM)刺激分别GC与卵泡，来构建模型。　　4、各干预药物浓度筛选：采用CCK-8细胞增殖试剂盒测定各药物作用的最适宜终浓度。　　5、实验分组：实验分成九个组。正常组(N组)：无任何药物干预；模型组(M组)：加入过量丙酸睾酮；FSH组：在模型组的基础之上同时加入适宜浓度的FSH；A组:在模型组的基础之上同时加入适宜浓度的中药复方；B组:在模型组的基础之上同时加入适宜浓度的乙醇提取溶液；C组:在模型组的基础之上同时加入适宜浓度的乙酸乙酯萃取物；D组:在模型组的基础之上同时加入适宜浓度的正丁醇萃取物；E组:在模型组的基础之上同时加入适宜浓度的乙醇沉淀物；F组:在模型组的基础之上同时加入适宜浓度的萃取后的水层。　　6、指标的测定：各干预药物作用GC或卵泡48小时后，测定细胞上清液中的雌二醇(E2)与孕酮(P)的含量以及检测卵泡对葡萄糖的摄取量和卵泡培养液葡萄糖的含量，同时采用RT-PCR和Western blot分别检测PCNA、FSHR、StAR mRNA与PCNA、FSHR、StAR、IGF-I、p-ERK1/2、p-P38、cyclinD2、CDK4、IRS-1和GLUT4蛋白表达水平。　　7、统计学方法：所有数据均以均数±标准差(x±s)描述，采用SPSS16.0统计软件进行组间t检验或Mann-Whitney U检验。P<0.05表示差别具有统计学意义。　　结果：　　1、提取的颗粒细胞24小时内就可以贴壁生长。　　2、经过摸索，作用GC的丙酸睾酮最适宜终浓度为250μM。　　3、经过CCK-8测定，FSH的最适宜终浓度为10ng/ml；养精种玉汤复方、乙醇提取溶液、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、乙醇沉淀物与萃取后水层的最适宜终浓度分别为细胞培养液中含其原溶液2.5％、1%、1%、1%、1%和5%。　　4、养精种玉汤及其有效部位对GC增殖分化的影响　　(1)细胞培养液上清液E2与P的测定：　　①各药物刺激组E2分泌量较N组均明显升高(P<0.001)，尤其以FSH组、C组、D组与E组最为显著。　　②M组P含量较N组低(P<0.001)，其他组P含量较M组高。C组GC将雄激素转化为雌激素的能力最强，且C组GC分泌孕酮的能力也是最强。　　(2)RT-PCR检测mRNA表达量：　　①过量的雄激素对GC增殖与分化是有抑制作用的。M组GC中PCNA、StAR和FSHR mRNA表达量较N组均明显下降(P<0.05)。而FSH组以及养精种玉汤其及有效部位药物刺激组GC的PCNA、StAR和FSHR mRNA均较M组升高(P<0.05)。　　②就GC的PCNA mRNA表达量来看，其中E组与FSH组升高最为明显；就StAR与FSHR mRNA表达量来看，FSH组、C组、D组与E组升高最为明显。　　(3)Western blot检测蛋白表达量：　　①M组 PCNA、FSHR、StAR、IGF-I、p-ERK1/2与p-P38蛋白表达量较N组均明显下降(P<0.05)。而当促卵泡生成素和养精种玉汤及其有效部位与过多雄激素联合刺激GC48小时后，PCNA、FSHR、StAR、IGF-I、p-ERK1/2与p-P38蛋白表达量较M组均增加(P<0.05)。　　②B组、C组、D组与E组GC的PCNA、StAR与FSHR蛋白表达量明显升高(P<0.05)。其中C组与D组对IGF-I蛋白升高最为明显。　　③从MAPK信号通路关键蛋白分子的测定结果可以得出，有效部位E对ERK有明显的激活作用，E组P-ERK表达量升高最为显著，而有效部位C对P38有明显的激活作用，C组p-P38表达量升高最为显著。　　5、养精种玉汤及其有效部位对GC周期调控的影响　　过多雄激素刺激GC48小时后，PCNA、cyclinD2与CDK4蛋白的表达量明显降低。经促卵泡生成素、养精种玉汤与其有效部位联合过多雄激素刺激GC48小时后，PCNA、cyclin D2与CDK4蛋白较M组升高，且均有统计学意义。E组cyclilnD2与CDK4蛋白升高比较明显，较FSH组升高约两倍。　　6、养精种玉汤对发育障碍模型卵泡(过多雄激素诱导卵泡胰岛素抵抗)的影响　　(1)模型卵泡胰岛素抵抗的鉴定：卵泡对葡萄糖摄取量的测定：正常组为(2006.33±99.62)cpm/3个卵泡，抵抗组为(1212.67±21.22)cpm/3个卵泡(t=13.496，P<0.01)。卵泡培养液上清葡萄糖含量的测定：正常组为(12.38±0.904)mmol/L，加用胰岛素刺激半小时后为(6.36±0.24)mmol/L；抵抗组为(15.98±0.661)mmol/L，加用胰岛素刺激半小时后为(11.06±0.36)mmol/L。卵泡产生IR后，其上清液中的葡萄糖含量明显升高，经t检验证明P<0.01，具有统计学意义。　　(2)IRS-1和GLUT4蛋白表达的测定：当卵泡胰岛素抵抗时，IRS-1的GSR为0.065，较正常组GSR(0.25)降低了74%(t=20.36，P<0.01)；GLUT4的GSR为0.05，较正常组GSR(0.926)降低了94.56%(t=92.217，P<0.01)。加入养精种玉汤复方改善胰岛素抵抗后，复方组IRS-1与GLUT4的GSR分别为0.202、0.31，较抵抗组分别升高了2倍与5倍(t=-21.61，P<0.01；t=-28.609，P<0.01)。　　(3)卵泡培养上清液残糖量的测定：正常组卵泡上清葡萄糖含量为(12.18±0.26)mmol/L。抵抗组卵泡上清葡萄糖含量为(15.48±0.35)mmol/L，较正常组升高27.09%(t=-16.973，P<0.001)，复方组卵泡上清葡萄糖含量为(10.28±042)mmol/L，较抵抗组降低了33.6%(t=21.264，P<0.001)，也较正常组低(t=8.601，P<0.001)。　　结论：　　1、TP对GC增殖有双重的作用，生理剂量的雄激素能促进GC增殖，而过高剂量的雄激素能够抑制细胞增殖甚至引起细胞死亡。　　2、TP能够促进GC生成E2，而C，D，E三个有效部位能够加强GC将雄激素转化为雌激素的能力，其可能是影响芳香化酶的活性而促进雄激素的转化作用，但有待进一步实验验证。TP能够抑制GC生成孕激素，而B，C，D，E四个效部位通过抑制雄激素阻止GC生成孕激素的作用，增加孕激素的分泌，为养精种玉汤在黄体期的运用提供实验依据和科学论据。　　3、养精种玉汤及其有效部位均能上调GC的FSHR、StAR、PCNA mRNA与蛋白水平的表达和增加GC的IGF-I、p-ERK1/2和p-P38蛋白的表达水平。因此，养精种玉汤及其有效部位促进GC增殖分化可能涉及ERK与P38 MAPK信号通路。其中有效部位E对GC的PCNA、FSHR及p-ERK1/2的增强效果较其他有效部位强。所以，我们推测有效部位E是养精玉汤促进GC增殖的主要药效部位，且其可能是通过激活ERK MAPK信号传导通路起到促进GC增殖的效果。另外，有效部位C对GC的StAR、IGF-I及p-P38的增强效果较其他有效部位更佳。因此，我们推测有效部位C是养精玉汤促进GC分化的主要药效部位，且其可能是通过激活P38 MAPK信号传导通路起到促进GC分化的效果。　　4、过多的雄激阻止GC周期的正常进行，从而抑制GC增殖。有效部位E增强cyclilnD2与CDK4蛋白的表达，其可能是养精种玉汤调控卵巢颗粒细胞周期的主要有效靶成分。　　5、过多雄激素诱导卵泡产生胰岛素抵抗，可以作为发育障碍的卵泡模型，用于研究卵泡发育障碍。养精种玉汤改善过多雄激素诱导卵泡胰岛素抵抗的机制是通过上调IRS-1和GLUT4蛋白，促进卵泡对葡萄糖的利用和摄取，从而改善卵泡的胰岛素抵抗，促进卵泡发育与成熟。