害虫抗药性直接威胁到人类的农业生产和健康安全,而新型杀虫剂的不断投入致使害虫抗药性更为多样,目前许多昆虫都产生了对多种类型杀虫剂的抗性。了解害虫抗药性机制的分子基础,包括抗药性相关基因的功能,对于设计害虫抗药性治理策略,以及开发新型高效杀虫剂,都是至关重要的。水稻是全球50%人口的主粮,而灰飞虱Laodelphax striatelus Fallen是一种水稻重要害虫,它通过吸食植株汁液和传播病毒病,在局部地区每年都会导致水稻大量减产。本研究重点研究灰飞虱的抗药性机理、交互抗性、多重抗性,以及抗药性相关基因的功能,以期为灰飞虱抗药性的预测和治理提供必要的理论依据。1、灰飞虱对乙虫腈抗性的分子机理本研究利用对乙虫腈具有较高抗性的田间种群,进行室内进一步筛选建立乙虫腈抗性品系,克隆其体内乙虫腈的靶标基因Rdl,并与敏感品系进行比较,同时检测71个相关解毒酶基因的表达水平,以确定其在乙虫腈抗性中的作用。结果发现,室内进一步筛选使灰飞虱对乙虫腈的抗性由田间种群的107倍上升到180倍;已报道的乙虫腈抗性相关靶标基因Rdl点突变A283N,在抗性个体中频率较低(1/4),不可能是所观察到的乙虫腈抗性的主要机制;分析细胞色素P450氧化酶、酯酶和谷胱甘肽转移酶,发现仅有细胞色素P450氧化酶与乙虫腈抗性有关;进一步分析发现CYP4DE1和CYP6CW3v2两个基因在灰飞虱抗乙虫腈品系中过表达(4.5和12.9倍);通过喂食dsRNA对这两个基因进行基因干扰发现,当这两个基因的表达量下降时(至50%和30%),试虫对乙虫腈的敏感性显著增加(等剂量死亡率分别由35%和35%上升到78%和81%)。上述结果表明,细胞色素P450氧化酶CYP4DE1和CYP6CW3v2在灰飞虱对乙虫腈抗性中具有重要作用。2、灰飞虱对吡虫啉抗性涉及到的细胞色素P450吡虫啉已经被广泛用于防治稻飞虱,灰飞虱田间种群对吡虫啉的抗性已有报道,为了更好地进行抗药性治理,本研究就灰飞虱对吡虫啉抗性的分子机理进行了研究。实验利用灰飞虱田间种群,在室内用吡虫啉经过24代筛选,建立了灰飞虱吡虫啉抗性品系(抗性净增加13.99倍)。增效剂增效试验以及体内酶活力分析发现细胞色素P450氧化酶与灰飞虱对吡虫啉的抗性有关。此后比较了57个细胞色素P450基因在抗性和敏感品系中的表达量,发现4个细胞色素P450氧化酶基因(CYP4C71v2、CYP4C72、CYP6AY3v2和CYP353D1v2)在吡虫啉抗性品系显著上调(1.67、7.96、8.94和1.82倍)。此后,利用4个抗性不同的灰飞虱品系(敏感品系、抗毒死蜱品系、抗溴氰菊酯品系和田间品系)为起始种群,用吡虫啉分别进行短期筛选,2代后检测10个已经报道的与灰飞虱抗药性有关的基因,结果发现个筛选品系中只有CYP353D1v2的表达量比筛选前显著上升,分别上升2.89、1.82、2.88和6.75倍,表明CYP353D1v2的表达水平与吡虫啉筛选具有密切关系。用喂食dsRNA的方法干扰CYP353D1v2基因,发现抑制四个品系的CYP353D1v2表达(至70%、53%、56%和66%)可以显著提高灰飞虱对吡虫啉的敏感性,四个品系的等剂量死亡率分别由30.9～31.4%上升到61.7%、由32.4～37.8%上升到72.5%、由42.8%上升到69.6%,以及由33.3～36.6%上升到59.0%。上述研究结果表明,吡虫啉长期筛选灰飞虱所产生的抗性涉及到CYP4C71v2、CYP4C72、CYP6AY3v2和CYP353D1v2四个基因,而短期筛选则主要是CYP353D1v2。3、灰飞虱对常用杀虫剂的交互抗性及其机理为了弄清灰飞虱对不同类型杀虫剂的交互抗性及其机理,本研究分别以田间种群和室内不同抗性品系的混合品系为起始种群,利用溴氰菊酯、毒死蜱和吡虫啉3种常用杀虫剂分别进行连续筛选,不同筛选获得的抗性品系用于测定交互抗性状况,并通过比较筛选抗性品系和敏感品系的代谢酶表达量的变化,分析交互抗性的可能机理。结果表明,在溴氰菊酯、毒死蜱和吡虫啉3种作用机制不同的杀虫剂之间普遍存在交互抗性。田间品系在溴氰菊酯筛选后,对溴氰菊酯的抗性升高到264倍时,对毒死蜱和吡虫啉的抗性也分别为49和24倍。室内抗性混合品系用溴氰菊酯筛选7代后,对溴氰菊酯的抗性由52倍升高到179倍,同时对毒死蜱的抗性由32倍升高到118倍,对吡虫啉的抗性也由18倍升高到69倍。用毒死蜱和吡虫啉筛选的品系也有类似的现象。在溴氰菊酯筛选品系中,CYP6AY3v2、CYP6FU1、CYP353D1v2和CYP439A1v3四个细胞色素P450氧化酶基因显著上调(1.8、2.0、1.8和4.5倍);在毒死蜱筛选品系中,是CYP6AY3v2、CYP306A2v2和CYP353D1v2三个基因显著上调(1.8、1.9和4.0倍);而在吡虫啉筛选品系中,是CYP4C72、CYP6AY3v2和CYP353D1v2三个基因(1.8、1.9和4.0倍)。即CYP6AY3v2和CYP353D1v2在三个不同药剂的筛选品系中均上调,并与这三个品系之间存在的交互抗性相一致。这些结果表明CYP6AY3v2和CYP353D1v2两个基因的过量表达与灰飞虱对溴氰菊酯、毒死蜱和吡虫啉3种不同药剂的交互抗性有关。4、灰飞虱细胞色素P450 CYP353D1v2对不同杀虫剂的降解作用细胞色素P450氧化酶已被证实参与多种化合物的代谢,包括杀虫剂。本研究又证实CYP353D1v2在灰飞虱对不同杀虫剂的抗药性中起作用,因此本研究利用Sf9细胞体外表达CYP353D1v2,以便测定其代谢吡虫啉和毒死蜱等杀虫剂的能力。实验结果表明,在Sf9细胞内成功表达了CYP353D1v2,PNOD活性由81.88上升到178.03 nmol min-1 mg-1蛋白。同时利用气谱分析底物减少和代谢物生成,检测了表达蛋白对吡虫啉和毒死蜱的代谢能力,发现在没有NADPH生成系统存在时,表达蛋白与杀虫剂共育产物的气谱图与母体化合物的气谱图相同,但添加NADPH后,表达蛋白与吡虫啉和毒死蜱共育,都产生了在气谱图上保留时间明显不同于母体(保留时间分别为2.3 and 9.7 min)的未知化合物流出峰(保留时间分别为13.6 and 1.4 min)。这一结果表明灰飞虱CYP353D1v2可以催化代谢吡虫啉和毒死蜱等杀虫剂,支持前述CYP353D1v2参与不同杀虫剂抗性,并在不同杀虫剂交互抗性中发挥作用的结论。结论认为,本研究在Sf9昆虫细胞中成功地表达了CYP353D1v2,证实了它可以催化降解毒死蜱和吡虫啉,并在灰飞虱对不同杀虫剂的交互抗性中发挥作用。5、灰飞虱田间种群的多重抗性及多种解毒酶的过量表达杀虫剂抗性是威胁害虫可持续治理的棘手问题,因此,了解田间抗药性的发生机制对于杀虫剂抗性治理是非常必要的。本研究测定了灰飞虱3个田间种群对阿维菌素、毒死蜱、溴氰菊酯、吡虫啉和乙虫腈等5种杀虫剂的抗性,及其与前期室内品系中已经鉴定的抗药性相关解毒酶基因的关系。实验利用点滴法进行抗药性毒力测定,利用定量PCR进行基因表达量的分析。结果表明,3个灰飞虱地理种群对所测定的杀虫剂都显示出明显的多重抗性,但对不同杀虫剂的抗性水平因种群而异。建湖种群对毒死蜱、溴氰菊酯和吡虫啉高抗(分别为302、114和53倍),但对阿维菌素和乙虫腈低抗(分别为7和4倍)。济宁种群对毒死蜱、乙虫腈和吡虫啉具有高和中等水平抗性(分别为170、107和23倍),而吴江种群对毒死蜱、溴氰菊酯和吡虫啉具有中高水平抗性(分别为164、29和14倍)。检测15个基因中的13个前期鉴定的灰飞虱抗药性相关基因,都至少在一个田间种群内高表达。在建湖、济宁和吴江三个田间种群中,高表达的基因数(分别为11、8和11个)、表达量最高的基因(CYP439A1v3、CYP6A3v2和CYP314A1v2)及其表达倍数(50.6、11.0和4.4)各不相同。分析认为,本研究揭示了灰飞虱田间种群的多重抗性,以及相应可变的高表达解毒酶谱,同时表明前期鉴定的抗药性相关基因同样在田间种群中发挥作用,用室内筛选品系研究可以获得有效信息。