溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)又称慢性非特异性溃疡性结肠炎，是原因未明的直肠和结肠慢性炎性疾病。病变主要累及黏膜及黏膜下层，以溃疡形成为病理改变的特征。临床主要表现为腹泻、黏液脓血便、腹痛和里急后重。过去认为，该病在欧美多见，亚非少见，因而对其重视不够。但近十几年的研究表明，UC在我国也是一种较常见的消化道疾病。溃疡性结肠炎起病缓慢，病程迁延，反复发作，病程长者，存在癌变的可能，给患者的生活工作带来诸多负面影响，严重降低了患者的生活质量。世界卫生组织已将本病确认为现代难治性疾病之一。目前，临床常用氨基水杨酸类和糖皮质激素类药物治疗UC，但存在易复发和一定程度的不良反应等问题。中医药治疗UC，在辨证论治、整体调节方面有其独特的理论基础和丰富的临床实践优势，具有良好的研究价值。古典经方——乌梅丸是治疗久泻久利的有效方剂，其治疗UC有着丰富的临床经验。加味乌梅丸是在中医理论的指导下，在临床经验的基础上，结合现代科研成果，组成的科研处方。本课题以加味乌梅丸为研究对象，旨在研究其对TNBS型溃疡性结肠炎大鼠的保护作用，探讨其治疗的免疫学机制。本论文包括以下几个方面：1．文献综述上篇主要通过查阅、整理国内外溃疡性结肠炎的相关资料，从中医和西医两个方面对其进行系统论述。在现代医学研究概况中，对UC的病因、发病机制和临床治疗进行了综述。尤其是对目前现代医学比较公认的免疫学发病机制进行了重点阐述。在中医学研究概况中，对中医学关于UC的病名归属，病因病机及治疗现状进行了综述。2．研究内容2．1处方研究在中医理论的指导下，以临床经验为基础，结合现代科研成果，组成处方加味乌梅丸。根据中医理论对该处方进行方解分析，将其功效定为益气健脾，涩肠止泻，调和寒热，活血止痛。该方可用于脾虚日久，寒热错杂，瘀血阻滞引起的腹痛，腹泻，里急后重，黏液脓血便。同时，本部分还对处方中诸药的药理进行综述，结合现代研究进展，进一步全面分析该处方。2．2加味乌梅丸对TNBS型大鼠溃疡性结肠炎保护作用的研究2．2．1加味乌梅丸对TNBS型结肠炎大鼠疾病活动指数(DAI)的影响选取SD雄性大鼠，随机分为6组，即正常对照组，模型组，SASP组，加味乌梅丸高、中、低剂量组。正常对照组采用生理盐水灌肠，其余各组均以TNBS／乙醇灌肠，复制溃疡性结肠炎模型。造模后第二天开始灌胃给药，正常对照组和模型组给予蒸馏水灌胃，SASP组给药量为0.5g／kg(相当于成人用药量的7倍)，加味乌梅丸高、中、低剂量组给药量分别为22.17g生药／kg体重、11.08g生药／kg体重、5.54g生药／kg体重(相当于成人用药量的14倍、7倍、3.5倍)，1.0ml／100g体重，1次／日，连续14天。每日称量体重，记录腹泻及大便性状，用于评价DAI。结果发现，给药6天后，模型组与治疗组之间出现差异。模型组与正常对照组之间差异极显著(P＜0.01)，DAI显著增高；各治疗组与模型组之间均有差异(P＜0.05)，均可使DAI降低，其中以中剂量组效果最好(P＜0.01)：中药治疗组与SASP组之间差异不显著(P＞0.05)。说明，本实验所复制的模型成功，同时也说明加味乌梅丸能够改善UC的症状，阻止溃疡性结肠炎的进一步发展，使TNBS型UC大鼠的损伤程度减轻，从而起到保护UC大鼠的作用。2．2．2加味乌梅丸对TNBS型结肠炎大鼠结肠组织病理形态学的影响给药后第15天取材，观察结肠长度、最大宽度、黏膜损伤指数及组织学评分的变化。结果显示，模型组大鼠结肠长度明显缩短(P＜0.01)，宽度明显增加(P＜0.01)，黏膜损伤指数和组织学评分显著增高(P＜0.01)；SASP组和加味乌梅丸各剂量组的结肠宽度增加(P＜0.05)，长度无缩短(P＞0.05)，结肠黏膜损伤指数降低极显著(P＜0.01)，组织学评分降低(P＜0.05)。进一步证实了本实验所复制的模型成功，验证了TNBS／乙醇模型的可靠性。结合病理形态学的改变，认为加味乌梅丸可通过减轻结肠炎症，促进结肠黏膜修复，恢复结肠分泌功能，从而起到治疗UC的作用。2．2．3加味乌梅丸对TNBS型结肠炎大鼠结肠组织中MPO含量的影响给药后第15天取材，剪取病变结肠组织，液氮保存，用于测量MPO含量。实验结果显示：模型组MPO含量显著升高(P＜0.01)。SASP组和高剂量组MPO含量降低(P＜0.05)；中剂量组MPO含量降低显著(P＜0.01)；低剂量组MPO无明显变化(P＞0.05)。高剂量组与SASP组比较，差异不显著(P＞0.05)：中剂量组与SASP组比较，差异显著(P＜0.05)。表明加味乌梅丸高、中剂量组能有效抑制炎性细胞浸润，减轻结肠炎症反应，而低剂量组则不能很好的抑制炎症。2．3加味乌梅丸治疗溃疡性结肠炎的免疫学机理研究2．3．1加味乌梅丸对TNBS型结肠炎大鼠血清中IL-6含量的影响给药后第15天，腹主动脉取血，采用双抗夹心ABC-ELISA法检测血清中IL-6的含量。结果显示：模型组IL-6的含量明显高于正常对照组(P＜0.01)：SASP组和加味乌梅丸高、中剂量组IL-6的含量显著降低(P＜0.01)；加味乌梅丸低剂量组与模型组之间差异不显著(P＞0.05)：加味乌梅丸高剂量组IL-6水平比SASP组低(P＜0.05)：加味乌梅丸中剂量组IL-6的含量显著低于SASP组(P＜0.01)。表明加味乌梅丸可通过下调IL-6，阻断其活性，抑制其介导的炎症反应，起到治疗UC的作用，且其下调作用受剂量影响。2．3．2加味乌梅丸对TNBS型结肠炎大鼠血清中TNF-α含量的影响采用双抗夹心ABC-ELISA法检测血清中TNF-α的含量。模型组TNF-α含量明显升高(P＜0.01)；与模型组相比，加味乌梅丸低剂量组TNF-α含量下降(P＜0.05)，SASP组和加味乌梅丸高、中剂量组与模型组差异极显著(P＜0.01)，可使TNF-α含量显著下降。高级量组效果不如SASP组好(P＜0.05)，中剂量组效果明显优于SASP组(P＜0.01)，低剂量组效果远不如SASP组好(P＜0.01)。提示加味乌梅丸可通过下调TNF-α而起到治疗UC的作用。2．3．3加味乌梅丸对TNBS型结肠炎大鼠淋巴细胞凋亡的影响采用Tunel法观察结肠黏膜固有层淋巴细胞凋亡的变化。结果显示，正常对照组阳性细胞表达少，且多是上皮细胞；模型组固有层可见少量淋巴细胞和其他炎性细胞阳性表达；SASP组和加味乌梅丸三个剂量组阳性淋巴细胞数量较多。与模型组相比，SASP组和加味乌梅丸三个剂量组淋巴细胞凋亡明显增多(P＜0.01)。表明加味乌梅丸可能是通过促进淋巴细胞凋亡，而起到治疗UC的作用。2．3．4加味乌梅丸对TNBS型结肠炎大鼠结肠组织NF-κB的影响采用免疫组化法观察结肠组织NF-κB的变化。结果显示，NF-κBp65在正常组无或仅有弱阳性表达；在模型组主要表达于单个核细胞和隐窝上皮细胞，肠上皮细胞也有少量表达，呈弥漫或颗粒状分布。大多数NF-κBp65的阳性染色都表现在核内，而仅有少量的NF-κBp65阳性细胞表现为胞质着色。与正常组相比，模型组表达显著增高(P＜0.01)。SASP组和加味乌梅丸三个剂量组NF-κBp65表达低于模型组(P＜0.05)。加味乌梅丸各剂量组与阳性药之间差异不显著(P＞0.05)。提示，加味乌梅丸可能是通过抑制NF-κBp65的激活起到治疗UC的作用。3．结论综合上述实验结果和结论，认为加味乌梅丸治疗溃疡性结肠炎与降低IL-6和TNF-α的水平，促进固有层淋巴细胞凋亡，抑制肠组织NF-κB的表有关。结合各指标的特性、功能及研究进展，进一步认为加味乌梅丸可能通过抑制TNF-α的产生而抑制NF-κB的激活，继而使IL-6及TNF-α的表达降低，通过对NF-κB和TNF-α的调节，促进肠黏膜固有层淋巴细胞凋亡，起到治疗溃疡性结肠炎的作用。