目的毒蘑菇中毒死亡人数占整个食物中毒死亡人数的比例达到35.57%[1],其中90%以上的死亡事件是由鹅膏菌属(Amanita)引起的,鹅膏菌的致死原因是其含有鹅膏肽类毒素。鹅膏肽类毒素不仅具有高毒性,也广泛应用于医学与基因工程等领域,具有重要的价值。但目前鹅膏肽类毒素只能从鹅膏菌中提取,尚不能人工合成,造成国内绝大多数鹅膏肽类毒素的标准品至今仍无法获得,其中毒伞肽更是少见。假淡红鹅膏菌(A.subpallidorosea)是我们课题组近年来新发现的一种剧毒鹅膏,其含有的鹅膏肽类毒素不仅种类多且含量高,因此我们以假淡红鹅膏为研究对象,建立准确可靠的分析与制备方法对其所含的毒素进行分离与鉴定。其次,我国主要剧毒鹅膏主要有灰花纹鹅膏(A.fuliginea)、致命鹅膏(A.exitialis)、裂皮鹅膏(A.rimosa)等。其外观相似,往往难以区分,常造成误食而引起中毒死亡。文献报道鹅膏菌种间毒素成分及含量存在差异。因此我们收集国内外12种常见的剧毒鹅膏菌,建立液相色谱指纹图谱,对12种鹅膏菌所含的鹅膏肽类毒素成分及含量进行差异性比较研究。此外,由DNA序列构建的系统发育树分析表明假淡红鹅膏与鳞柄白鹅膏(A.virosa)聚在一个分支上,从基因水平上表明他们具有亲缘关系,毒素分析也表明两者都含有同一种毒伞肽(Virotoxins)即二羟毒伞肽(Viroidin),而目前国际上较少有人对假淡红鹅膏和鳞柄白鹅膏的毒素成分进行系统性的比较分析。因此我们采集不同产地的假淡红鹅膏与鳞柄白鹅膏,建立液相色谱指纹图谱,比较分析两种鹅膏菌以及不同采集地的同种鹅膏菌间的同一性与多样性。另外,鹅膏菌中毒后存在假愈期,常造成误诊。因此,在鹅膏菌中毒的救治中,早期正确诊断对病人的成功救治十分重要,这就需要建立人体生物样本中鹅膏肽类毒素的快速确证及定量分析方法。因此本研究建立了α-鹅膏毒肽(α-Amanitin,α-AMA)、β-鹅膏毒肽(β-Amanitin,β-AMA)、二羟鬼笔环肽(Phalloidin,PHD)、丙氨酸羟毒伞肽(Ala-viroidin)以及二羟毒伞肽在人体血浆与尿液中的快速毒素确证及定量方法。方法随着液相色谱-质谱联用技术(LC-MS/MS)的不断发展,LC-MS/MS已成为分析该类毒素的重要方法,其所需样品量少、灵敏度高以及速度快等。本文采用高效液相色谱(HPLC)与高分辨质谱联用法(HRMS)分离、鉴定假淡红鹅膏菌中的毒素成分,并对其中的鹅膏肽类毒素进行纯化。样品经含0.5%甲酸的50%甲醇水溶液提取后,采用Agilent 300Extend-C18色谱柱,含0.05%三氟乙酸(TFA)的乙酸铵(20 mmol/L)水溶液-甲醇为流动相进行梯度洗脱分离。进一步对12种剧毒鹅膏菌以及不同产地的鳞柄白鹅膏、假淡红鹅膏中毒素成分及含量差异进行了比较分析本文采用LC-MS/MS对人体血浆、尿液中α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、二羟鬼笔环肽、丙氨酸羟毒伞肽、二羟毒伞肽进行同时测定;采用固相萃取技术,建立了高通量、快速、简单且回收率高的样品净化方法。结果假淡红鹅膏的实验结果表明:假淡红鹅膏中共检出12种组分,经鉴定9种为已知鹅膏肽类毒素,其中4种为鹅膏毒肽(Amatoxins),2种为鬼笔环肽(Phallotoxins),3种为毒伞肽;另外也检出3种未知新组分,其中1种为二羟鬼笔环肽同分异构体,2种推断为新的环七肽毒素。值得一提的是,在假淡红鹅膏菌中同时检出丙氨酸羟毒伞肽、二羟毒伞肽和三羟毒伞肽(Viroisin)3种毒伞肽,实属罕见。同时,采用制备液相色谱纯化了9种毫克级鹅膏肽类毒素,纯度均在95%以上。可见,本研究为鹅膏肽类毒素的开发利用提供了新的资源以及为突发性毒蘑菇中毒事件的快速诊断提供了有效的技术支持。通过12种鹅膏菌的高效液相色谱图比较可知,鹅膏菌种间的毒素成分及相对含量差异较大,呈现显著的色谱指纹特征信息,其中共检出19种化合物,13种属于已知鹅膏肽类毒素,1种为二羟鬼笔环肽的同分异构体,并且在多数鹅膏菌中均检出该毒素。4种为未知鹅膏肽类新毒素,1种为未知小分子化合物组分,不属于肽类毒素,且菌种不同鹅膏肽类毒素成分及种类差异明显,这与文献报道结果一致。另外,假淡红鹅膏与鳞柄白鹅膏的研究结果表明,不同产地的假淡红鹅膏毒素种类均多于鳞柄白鹅膏,α-鹅膏毒肽的含量均高于鳞柄白鹅膏,且不同产地的鳞柄白鹅膏均不含β-鹅膏毒肽。其次,产地不同,鳞柄白鹅膏的毒素成分与含量均存在明显差异,而假淡红鹅膏的毒素成分无明显差异,但含量则不同。进一步,本文建立了生物样本中包括毒伞肽在内的5种鹅膏肽类毒素快速确证及定量方法,该方法的灵敏度高且准确度、精密度、回收率及基质效应等均符合方法学验证要求。为临床上突发性蘑菇中毒的应急检测提供了技术支持。本研究对正确识别鹅膏菌的种类,预防和鉴别鹅膏毒肽中毒事件以及临床诊断及治疗提供了有效的科学依据。结论本研究建立了鹅膏菌中毒素分析、制备及鉴定的方法,完成了9种主要鹅膏肽类毒素参考品的制备,纯度均在95%以上,并发现2种新毒素;同时,证明假淡红鹅膏是目前含有鹅膏肽类毒素成分最多且含量最高的新菌种。进一步,建立了多种剧毒鹅膏菌的指纹图谱,完成了毒素成分及含量的测定,能够实现剧毒鹅膏菌种间毒素成分及含量的同一性与多样性的比较;能够实现鹅膏菌种间的分类识别。另外,建立了简单、耗时短、回收率高以及可同时定量分析生物样本中多种鹅膏肽类毒素的LC-MS/MS方法。