【摘 要】
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猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起猪的一种高度接触性、致死性传染病。我国采用猪瘟兔化弱毒疫苗免疫为主的措施防控猪瘟,该疫苗安全有效,不仅对不同基因型CSFV株产生完全的交叉免疫保护,适当加大免疫剂量还能减轻或抑制母源抗体干扰。通过监测抗体水平,评价疫苗免疫效果,制定个性化免疫程序,提高群体免
【基金项目】
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国家重点研发计划（编号:2016YFD0500701和2016YFD0500707）; 河南省科技攻关项目（编号:192102110007）
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猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起猪的一种高度接触性、致死性传染病。我国采用猪瘟兔化弱毒疫苗免疫为主的措施防控猪瘟,该疫苗安全有效,不仅对不同基因型CSFV株产生完全的交叉免疫保护,适当加大免疫剂量还能减轻或抑制母源抗体干扰。通过监测抗体水平,评价疫苗免疫效果,制定个性化免疫程序,提高群体免疫水平,已成为猪瘟预防控制的迫切需求。此外,当前非典型猪瘟流行普遍,与其他猪病混合感染现象日趋严重,仅依靠临床症状和病理解剖难以对猪瘟进行确诊,必须依赖实验室诊断方法。本研究围绕猪瘟病毒抗体快速检测和猪瘟的早期诊断,开展了免疫层析试纸的研制。主要研究内容如下:1.猪瘟病毒E2蛋白的真核表达纯化及免疫原性分析利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在gp67信号肽介导下高效分泌表达了删除跨膜区的CSFV E2蛋白,得到的E2蛋白糖基化水平较高,更接近其天然构象,且蛋白产率较高,达到25 mg/L。经兔体试验评估其诱导免疫保护水平,接种CSFV-E2的家兔产生了较高水平的E2特异性抗体和中和抗体,为后续猪瘟抗体检测研究及单克隆抗体制备奠定了良好的基础。2.猪瘟抗体检测试纸的研制利用上述制备的CSFV E2蛋白,研制了一种用于猪瘟抗体快速检测的免疫层析试纸。通过对试纸制备的各个环节进行优化,使猪瘟E2抗体检测试纸的准确性、灵敏度及稳定性满足商品化需求。对猪瘟阳性血清国家参考品进行倍比稀释检测,猪瘟E2抗体检测试纸的阳性检出限为1:102400。该试纸具有良好的特异性,与其他主要猪病阳性血清无交叉反应。CSFV E2抗体检测试纸具有良好的重复性和可靠性,组内、组间变异系数CV均小于15%。常温保存15个月,猪瘟E2抗体检测试纸的性状、敏感性、特异性、均一性均未发生变化。通过对临床813份猪血清检测,以IDEXX CSFV Ab Test Kit试剂盒检测结果为参考,猪瘟E2抗体检测试纸的特异性为91.04%（61/67）、敏感性为97.72%（729/746）、符合率为97.17%（790/813）。因此,本研究研制的猪瘟E2抗体检测试纸具备方便、快速、准确、高灵敏度、高特异性的特点,可用于临床猪瘟抗体检测,为猪瘟防控提供技术支持。3.猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定利用CSFV E2蛋白作为免疫原,以10μg低剂量抗原免疫BALB/c小鼠,按照常规方法将免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0进行融合,通过间接免疫荧光方法进行筛选,经有限稀释法亚克隆3次,获得2株稳定分泌抗CSFV E2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株12B5和19A3。小鼠体内诱生单克隆抗体,纯化腹水,得到高浓度和高纯度的单抗。经亚型鉴定,2株单抗重链均为Ig G1型,轻链均为Kappa型。间接ELISA检测2株单抗效价均为1:102400,IFA检测显示单抗12B5效价为1:6400,单抗19A3效价为1:1600。按照生物信息学B细胞表位预测,人工合成8条CSFV E2蛋白1-331氨基酸亲水区肽段,与单抗12B5进行反应。间接ELISA法和Dot-blot结果表明单抗12B5识别的抗原表位为147LRTEVVKTFRREKPFPHRMDC167,在E2蛋白结构中是突起的β折叠和loop结构,完全暴露在表面,具有较强的亲水性和抗原性。4.猪瘟病毒快速检测试纸的研制利用高灵敏度、高亲和力的单克隆抗体12B5,采用标记单抗-多抗拦截的检测模式,研制了一种用于猪瘟病毒快速检测的免疫层析试纸。对梯度稀释的CSFV石门株细胞培养物进行检测,猪瘟病毒快速检测试纸的阳性极限稀释度为1:128,病毒载量为1.108×10~3copies/μL。猪瘟病毒快速检测试纸具有良好的特异性,与其他主要猪病的病毒细胞培养物无交叉反应。通过对50份临床样品检测,以猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法为参考,猪瘟病毒快速检测试纸的特异性为100%（35/35）,敏感性为86.67%（12/15）,符合率为94%（47/50）。因此,猪瘟病毒检测试纸具有方便、快速、高灵敏度、高特异性的特点,适用于临床猪瘟病例初步检测。综上所述,本研究制备了CSFV E2蛋白研制了一种用于猪瘟抗体快速检测的免疫层析试纸,具有较高的准确性、灵敏度和稳定性,可用于猪瘟抗体检测。制备了特异性单克隆抗体,采用标记单抗-多抗拦截的检测模式,研制了一种用于猪瘟病毒快速检测的免疫层析试纸,在临床组织样品检测中,显示了较高的敏感性和特异性,可代替CSFV实时荧光RT-PCR检测方法用于猪瘟临床病例的快速诊断。
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