研究背景和目的鼻咽癌(NasoPharyngeal Carcinoma,NPC)是我国南方五省及东南亚地区高发的头颈部恶性肿瘤之一,它的发病是一个多基因参与、多途径作用、多阶段逐渐演变的过程,涉及了一些关键的瘤基因和抑瘤基因,但其发病的分子机制仍未阐明。目前,普遍认为EB病毒感染、遗传因素和化学致癌物是导致鼻咽癌发生的三大主要原因。肿瘤的致瘤性和转移性往往是在临床治疗的过程中最难攻克的难关,也引起了无数肿瘤基础研究者的浓厚兴趣和深入研究。那么在鼻咽癌的成瘤和转移的过程中,到底有哪些基因影响了鼻咽癌的成瘤,而又有哪些基因和通路在鼻咽癌转移的过程中起到了重要作用?既往的研究已经发现了一些瘤基因、抑瘤基因、转移促进基因和转移抑制基因,但我们相信在鼻咽癌中起作用的远远不止这些。所以课题组拟通过生物信息学的方法来继续寻找潜在的瘤基因并用实验进行验证,同时挖掘鼻咽癌的转移相关基因及调控通路。在课题组早期的工作中,黄仲曦副教授结合鼻咽癌细胞株的SNP芯片和表达谱芯片,在鼻咽癌的早期事件12p12-11扩增区域中找到了在鼻咽癌细胞株中一致扩增而相对于NP69一致过表达的基因,即PTHLH。接着用荧光定量PCR对细胞株中PTHLH的拷贝数和表达进行验证,实验结果与芯片结果大体一致。对17例鼻咽癌组织进行RT-PCR,结果显示PTHLH在64.7%的鼻咽癌组织中表达上调。免疫组化显示PTHLH在83%的鼻咽癌组织中表达上调。基于这些实验结果把PTHLH定为是一个候选的鼻咽癌瘤基因。因此,在本课题第一部分中,我们拟通过分子生物学实验来验证PTHLH在鼻咽癌细胞株中的致瘤能力。关于鼻咽癌转移机制研究,已经有一些转移相关基因和通路被发现和证实,但是其机制仍然不是十分清楚,我们相信还有更多的转移相关基因有待挖掘和验证。在本课题的第二步研究中,我们拟通过鼻咽癌细胞株5-8F和16-10B来挖掘与鼻咽癌转移特性密切相关的基因。鼻咽癌细胞株5-8F和6-10B均来自同一母细胞株SUNE-1,既往的研究已经证实,5-8F具有高成瘤、高转移能力,而6-10B则只成瘤、不转移。先前也已有一些基于这两个细胞株的差异转录组学和蛋白质组学等高通量研究报道。但是过去的高通量研究具有明显的局限性,通常只检测了人类大约25,000个基因中的不到8,000个。考虑到过去高通量研究方法处理量的局限性,我们拟通过全基因组微阵列技术来更加全面地研究5-8F和6-10B细胞株的生物学特性,挖掘出它们之间的差异表达基因和转移相关基因并进行初步分析。方法1.靶基因PTHLH在鼻咽癌细胞株中的表达特性鉴定采用荧光定量PCR法和Western blot,分别从mRNA水平和蛋白水平检测PTHLH在永生化鼻咽上皮细胞NP69和鼻咽癌细胞5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、HONE1中的表达水平,初步探讨PTHLH在永生化鼻咽上皮细胞和鼻咽癌细胞中的表达差异,结合芯片数据,找到高表达PTHLH的鼻咽癌细胞株作为下一步干扰对象。2. PTHLH表达沉默对鼻咽癌细胞生物学影响构建靶基因PTHLH的慢病毒干扰、阴性对照载体,包装成成熟的慢病毒颗粒感染高表达PTHLH的6-10B细胞,通过有限稀释法,倒置荧光显微镜下挑取单克隆的方法筛选出稳定的阳性和空载克隆,荧光定量PCR检测各干扰克隆细胞中PTHLH干扰效率,筛选干扰效率最高的细胞克隆作为实验对象进行后续实验研究。MTT法、流式细胞术检测细胞周期及平板克隆形成实验检测PTHLH沉默后对细胞体外增殖的影响；Transwell检测PTHLH沉默后细胞迁移运动和侵袭能力的改变。3.鼻咽癌细胞株5-8F和6-10B差异表达基因的微阵列分析我们通过提供5-8F和6-10B细胞株的mRNA样本,交由公司制作表达谱芯片,采用的是Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0微阵列(包含54,675个探针集,几乎涵盖了人类基因组的所有基因)通过三次生物学重复检测这两个细胞株,采用近期发表的两个软件来挖掘转移相关基因及其分子机制。其一是GOEAST(Gene Ontology Enrichment Analysis Software Toolkithttp://www.omicslab .genetics.ac.cn/GOEAST/),用来分析差异表达基因主要参与的生物学过程和分子功能。其二是GenCLiP(http://www.genclip.com),通过挖掘文献进行基因聚类和构建基因共发生网络,揭示差异表达基因参与的发病分子机理、基因网络和调控通路。4.统计学方法采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理,荧光定量PCR法检测鼻咽癌细胞株PTHLH表达特性结果比较采用单因素方差分析,多重比较采用SNK检验。第二章中荧光定量PCR、运动、侵袭实验、平板克隆形成实验和细胞周期采用单因素方差分析；MTT采用析因设计的方差分析；多重比较采用SNK检验。结果1.靶基因PTHLH在鼻咽癌细胞株中的表达特性鉴定1)荧光定量PCR法检测PTHLH在永生化鼻咽上皮细胞NP69和鼻咽癌细胞5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、HONE1表达水平,差异有统计学意义(F=100.473,P=0.000),6-10B和HONE1表达最高。2) Western blot检测PTHLH在鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、HONE1中的蛋白表达水平,应用Image-Pro Plus图像分析软件计算各条带的光密度值,计算各细胞株的PTHLH表达率。结果显示PTHLH在6-10B、HONE1中高表达。选择6-10B作为干扰的靶细胞株进行后续试验。2. PTHLH表达沉默对鼻咽癌细胞生物学影响1)构建慢病毒干扰载体和阴性对照载体,包装慢病毒后感染6-10B细胞,有限稀释法于倒置荧光显微镜下挑取GFP+单克隆,荧光定量PCR检测各克隆的PTHLH表达情况,筛选出干扰效率最高的克隆2(94.1%)为下一步实验的研究对象。阳性克隆的干扰效率与6-10B和阴性对照细胞表达差异有统计学意义(F=59.833,P=0.000),同时检测PTHLH在阴性对照中的表达相对于6-10B强度较一致(0.809±0.187)。阳性干扰克隆命名为6-1 OB/PLVTHM-PTHLH,阴性对照克隆为6-10B/PLVTHM。2)MTT法检测细胞增殖情况,与阴性对照6-10B/PLVTHM和6-10B细胞相比,干扰克隆细胞6-1 OB/PLVTHM-PTHLH的增殖速度明显减慢并且呈时间依赖关系,有统计学差异(F=65526.028,P=0.000)；流式细胞术结果表明各组细胞中G1期、S期和G2／M期差异均无统计学意义(P值分别为0.132、0.076、0.109)；平板克隆形成实验显示三组细胞的克隆形成率差异有统计学意义(F=118.940,P=0.000),6-1 OB/PLVTHM-PTHLH细胞克隆形成减少,6-10B和阴性对照组差异无统计学意义(P=0.345)。综合表明PTHLH表达干扰后,6-10B细胞体外生长被抑制。3)Transwell小室检测结果显示,与6-10B和6-10B/PLVTHM细胞相比,6-10B/PLVTHM-PTHLH细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数减少,差异具有显著性(F=1966.153,P=0.000)。说明PTHLH表达沉默降低了6-10B细胞的体外运动能力。4)用荧光定量PCR法检测PTHLH沉默后细胞株中DKK1及b-catenin基因的表达水平的改变,结果显示相对于6-10B及阴性对照细胞株,干扰后的细胞株DKK1及b-catenin的表达水平未出现明显改变,差异无统计学意义(F=0.104P=0.903／F=0.210 P=0.816)。3.鼻咽癌细胞株5-8F和6-10B差异表达基因的微阵列分析通过分析表达谱芯片数据,筛选出了60个差异表达基因,并在这60个基因中选取8个基因进行了荧光定量PCR验证,实验结果与芯片结果具有高度的一致性,验证了芯片结果的可靠性。用在线软件GOEAST对差异表达基因进行分析,发现大部分差异表达基因参与了细胞和代谢过程,具有催化活性、离子结合能力和蛋白结合能力。将差异表达基因与所感兴趣的关键词进行聚类分析,发现这些基因与凋亡、细胞周期、转移、趋化因子和免疫编辑特异相关。以“转移”为关键词构建基因网络图,发现差异表达基因中有42个为转移相关基因(P<0,00001)1其中11个基因形成了7个基因对(P=0=013)。在转移相关网络图中发一现了在本课题中进行验证的候选瘤基因PTHLH,和DKK1有着某种联系。在研究PTHLH-DKK1-Wnt通路中,推测DKK1对Wnt通路的抑制作用可能是导致6-10B低转移的原因,而实验结果证实PTHLH对DKKl并没有起到单独的抑制作用。结论1.荧光定量PCR法和Western blot检测PTHLH在鼻咽癌细胞5-8F、6-10B、CNE1、CNE2中的mRNA和蛋白水平的表达均有差异,6-10B和HONE1表达最高。选择高成瘤细胞株6-10B为进一步干扰对象。2.利用慢病毒载体和RNAi技术建立了PTHLH表达稳定下调的6-10B细胞株,干扰后细胞体内、外生物学功能发生较明显的改变。PTHLH表达下调抑制了6-10B细胞株的生长和侵袭。说明PTHLH在6-10B细胞株的高成瘤中起到了一定的促进作用。3.在不同转移特性的细胞株5-8F和6-10B之间筛选出60个差异表达基因,参与细胞和代谢过程,与凋亡、细胞周期、转移、趋化因子和免疫编辑特异相关。找出了42个转移相关基因,构建了转移相关基因网络图。在研究PTHLH和DKK1-Wnt通路中,推测DKK1可能通过调节Wnt通路影响鼻咽癌的转移。而DKK1的活性不单独受PTHLH的影响。PTHLH能够促进鼻咽癌细胞株6-10B的成瘤,但是与5-8F和6-10B的转移特性无关。