论文部分内容阅读
背景:分化型甲状腺癌(DTC)按细胞组织学类型分为甲状腺乳头状癌(PTC)和甲状腺滤泡状癌(FTC),占甲状腺恶性肿瘤的95%。近年来的发生率逐年快速增长,已成为世界女性发病率增长最快的恶性肿瘤。DTC具有发展缓慢、治疗效果及预后良好等特点,其5年存活率为98.1%。目前治疗上主要采取手术切术、RAI治疗、内分泌抑制治疗等手段的联合应用,可以使绝大多数DTC得到完全缓解、部分缓解或病情稳定。但是临床上仍有部分患者出现病灶失分化的特点,病情持续进展,从而失去摄碘功能而无法从RAI治疗中获益,临床上称为碘难治性分化型甲状腺癌(RAIR-DTC)。这部分患者10年生存率仅为仅为15%-20%。以阿霉素(DOX)为基准的化疗曾是RAIR-DTC患者的唯一选择,但是由于药物浓度在甲状腺肿瘤内分布较低,并具有明显的心脏和血液毒性被限制应用。10年前多激酶抑制剂引入RAIR-DTC治疗之中,但是仅延长了无进展中位生存时间,对整体生存率并未产生影响。因此RAIR-DTC的治疗目前是临床的难点及焦点之一。近些年来,纳米粒子药物载体在抗肿瘤药物应用领域的潜在价值日渐得到显现,事实上,有许多纳米抗肿瘤药物已批准应用于临床或临床试验。为了提高RAIR-DTC治疗效果,降低化学治疗全身副作用,本研究利用理化性质优良的二氧化硅(SIO2)纳米粒子作为药物载体负载对RAIR-DTC有效的细胞毒性药物阿霉素,能够通过实体瘤特有的EPR效应获得负载药物在肿瘤部位选择性聚积及滞留。促甲状腺激素受体(TSHR)在碘难治性或者低分化的DTC复发/转移病灶,仍然具有高特异性,是针对RAIR-DTC高特异性靶点,之前已有TSH已引入到这些纳米颗粒中进行甲状腺癌靶向定位的研究。其提高抗癌效果及局部增加载体纳米颗粒浓度已经被报道。TSHR与TSH的这种特异性结合可适用于纳米靶向递送系统。然而,为了进一步降低副作用、增加纳米颗粒的治疗效果,酸触发式抗癌药物的释放是更为理想。目的:本研究旨在构建一种靶向递送、靶向释放的抗肿瘤纳米药物,为碘难治性分化型甲状腺癌治疗提供新的方向。方法:(1)制备具有TSHR靶向性及酸触发释放特性的TSH-SiO2@DOX纳米粒子;(2)透射电镜及DLS检测纳米粒子的形态及直径是否符合纳米药物特点;(3)不同PH值条件下释放实验及主动靶向实验检测纳米载药粒子酸响应性释放及TSHR主动靶向特性;(4)功能表型实验选取失分化细胞系FTC-133,采用激光共聚焦和流式细胞术检测FTC-133细胞对TSH-Si O2@Dox内吞,MTT法和集落形成实验观察细胞毒性,流式细胞术测定细胞凋亡水平;(5)体内验证实验构建甲状腺癌皮下移植瘤模型,TSH-SiO2@Dox纳米粒子治疗后进行抑瘤效果评价,肿瘤组织中凋亡相关基因的表达情况及系统安全性评估。结果:1.成功制备TSH-Si O2@DOX纳米粒子,TEM及DLS检测其粒径及特点符合作为纳米药物的要求,能够通过实体瘤特有的EPR效应获得负载药物在肿瘤部位选择性聚积。2.抗肿瘤药物阿霉素和纳米粒子之间的酸响应性连接,使其在PH值低于正常组织的肿瘤内部可以靶向释放。3.在纳米粒子表面键和TSH后,使其具备了RAIR-DTC治疗上的主动靶向作用。4.TSH-SiO2@Dox可特异性结合于FTC-133细胞表面,并被内吞至细胞内,且随时间延长内吞量逐渐增加。5.TSH-SiO2@Dox对FTC-133细胞具有更强的细胞毒性作用,且呈剂量依赖性。6.TSH-SiO2@Dox可显著增加阿霉素诱导FTC-133细胞的凋亡水平。7.TSH-SiO2@Dox显著抑制裸鼠皮下移植瘤(FTC-133细胞)的生长,提示具有较好的抑瘤作用。8.TSH-SiO2@Dox可上调促凋亡基因caspase-3和caspase-9的表达、同时下调抑制凋亡基因Bcl-2表达,提示可增加Dox诱导的凋亡水平。9.TSH-SiO2@Dox并未影响裸鼠的体重变化,且未引起器官损害,可显著降低抗肿瘤药物副作用,安全性良好。结论:1.本研究成功制备TSH-Si O2@Dox纳米粒子。其本身具备EPR效应的被动靶向作用,键和TSH使其获得了主动靶向作用。同时阿霉素和纳米粒子之间的酸响应性连接使其实现了肿瘤内部的靶向释放。2.体外实现显示TSH-SiO2@Dox可被FTC-133细胞特异性摄取,与游离Dox相比具有更强的细胞毒性作用,并可显著提高Dox诱导凋亡的能力。3.体内实验显示该粒子具有明显的抑瘤作用,其机制可能是通过TSH受体主动靶向及EPR效应迅速进入肿瘤内部,在酸性环境下触发释放Dox,维持肿瘤局部药物处于高浓度,起到细胞毒性作用。同时通过上调凋亡因子caspase-3和caspase-9表达并下调抗凋亡因子Bcl-2表达,诱导甲状腺癌细胞发生凋亡。4.系统安全性评估提示该粒子具有组织分布特异性和释放特异性,可显著降低抗肿瘤药物副作用,安全性良好。综上所述,本研究制备的TSH-SiO2@Dox纳米粒子,可为碘难治性甲状腺癌治疗提供新的方向。