目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最严重的慢性微血管并发症,是导致终末期肾衰竭(end-stage renal failure,ESRF)的主要病因,如何早期有效防治DN已成为当今国内外学者热切关注的课题。DN的发病机制非常复杂,长期以来认为是在以高血糖引起的糖脂代谢紊乱的基础上,多种因素综合作用的结果。越来越多的研究发现炎症及氧化应激在DN的发生和发展中起重要作用。肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)是肾脏重要的固有细胞(inherent cell)之一,在肾脏的组织结构和生理功能方面发挥着重要作用,具有产生细胞外基质、分泌细胞因子、吞噬和清除异物等多种功能。GMC也是多种致病因子作用的主要靶细胞,在病变进展中扮演着重要角色。Megsin是一种系膜细胞优势表达基因,其表达产物属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor,serpin)超家族成员。Serpin家族成员众多,功能涉及凝血、纤溶、炎症、细胞增殖、凋亡、信号转导、消化等多个系统。Megsin可作用于其底物纤溶酶(plasmin)并抑制其活性,从而直接或间接抑制细胞外基质降解。研究表明,在IgA肾病、DN和大鼠抗Thy-1肾炎模型中megsin表达上升,提示megsin与系膜细胞增生和系膜外基质积聚密切相关。目前有关megsin具体生物学功能还很不清楚,其在DN中的作用机制鲜有深入研究报道。研究表明,高血糖、炎症细胞因子、活性氧、血管紧张素II等均可激活p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated Protein Kinase,p38MAPK)信号通路,它不仅参与细胞的存活、分化和凋亡等过程,还在炎症、应激反应中具有重要作用,是细胞信息传递的交汇点或共同通路。研究发现糖尿病时单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)及细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达增多与p38MAPK通路激活密切相关。MCP-1及ICAM-1过度表达可介导大量巨噬细胞趋化和激活,加重糖尿病肾损伤。DN时MCP-1和ICAM-1水平可作为衡量炎性反应程度的指标。糖尿病状态下,肾组织中活性氧产生大量增加,导致脂质过氧化终产物丙二醛(MDA)生成增多,总超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)等抗氧化酶活性下降,引起肾损害。肾素——血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)的激活,是DN发病机制中的关键环节,血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)是其主要效应分子。因此,抑制AngII的产生并干扰其作用是DN治疗的关键。缬沙坦是血管紧张素II 1型受体拮抗剂(angiotensin II receptor I antagonist,AT1Ra),新近研究发现这类药物具有一定的非依赖降压的肾脏保护作用。本研究分别构建megsin质粒和megsin siRNA质粒,转染CD-1小鼠和小鼠肾脏系膜细胞,从整体、细胞和分子水平系统观察megsin、p38MAPK信号通路、炎症因子MCP-1、ICAM-1及氧化应激相关指标MDA、T-SOD、GSH-PX的变化,及其之间的相互关系,探讨megsin参与早期DN发生的作用机制;并通过肾小球系膜细胞药物干预实验,观察血管紧张素II 1型受体拮抗剂缬沙坦对megsin表达及p38MAPK信号通路活化的影响,探讨缬沙坦肾脏保护作用的机制,最终为筛选从基因或蛋白水平阻断megsin致病作用的有效途径,进一步阐明DN发病的分子学机制及其防治提供一条新思路。方法:第一部分:健康雄性CD-1小鼠48只,戊巴比妥钠腹腔麻醉(5mL/kg)后行左肾切除术,2周后切口完全愈合。小鼠随机分为两组:左肾切除对照组(CN,n=24)和糖尿病组(DM,n=24)。其中DM组小鼠腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ,150 mg/kg溶于0.1mol/L枸椽酸缓冲液中,pH值4.5),CN组只注射相同体积的枸橼酸缓冲液,72h后尾尖取血,血糖仪测定血糖,尿糖试纸测定尿糖,血糖≥16.7mmol/L,尿糖+++~++++者确定为糖尿病模型。分别于注射STZ后1、2、4和12周末每组取6只小鼠,收集血、尿和肾组织标本,测定血糖(blood glucose,BG)、血肌酐(serum creatinine,Scr)、肾重/体重比值(Kidney weight/body weight ratio,KW/BW)、24h尿蛋白(Urinary protein,UP);光镜、电镜观察肾脏病理改变,免疫组织化学染色和Western blot检测肾组织megsin、p38MAPK、p-p38MAPK、MCP-1和ICAM-1蛋白的表达。第二部分:构建megsin表达质粒和megsin siRNA质粒。选择CD-1小鼠共30只,经单侧肾切除后,随机选取6只作为正常对照组(A组,n=6),其余24只一次性腹膜腔注射STZ(150mg/kg),制备糖尿病模型,成模后随机选取6只作为糖尿病组(B组,n=6),剩余18只经尾静脉分别注射空质粒,megsin质粒和megsin siRNA质粒,每周1次,分别为(C组、D组、E组,各组n=6),实验共4周。于第4周末收集各组小鼠血、尿和肾组织标本,测定BG、Scr、KW/BW、UP,光镜、电镜观察肾脏病理改变,免疫组化和Western blot检测肾组织megsin、p38MAPK、p-p38MAPK、MCP-1、ICAM-1蛋白表达,分别应用硫代巴比妥酸(TAB)法、黄嘌呤氧化酶法、二硫代二硝基苯甲酸法测定肾组织中脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量及总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性的变化。第三部分:用含10%胎牛血清及100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM/F12培养基培养小鼠肾小球系膜细胞,传代后接种于96孔板,无血清培养基同步培养24h。用MTT法观察不同时间(12、24、48h)高糖及megsin对细胞增殖状态的影响。将系膜细胞分为5组:低糖组(A组,非转染的系膜细胞,5.5mmol/L葡萄糖)、高糖组(B组,非转染的系膜细胞,30mmol/L葡萄糖)、高糖+空质粒组(C组,转染空质粒的系膜细胞,30mmol/L葡萄糖)、高糖+megsin转染组(D组,稳定表达megsin的系膜细胞,30mmol/L葡萄糖)和高糖+megsin siRNA转染组(E组,脂质体2000转染megsin siRNA质粒,30mmol/L葡萄糖)。分别在6孔板和25cm2塑料培养瓶内培养。分别于培养12、24和48小时末收集细胞,提取细胞总蛋白及细胞上清液。应用免疫细胞化学和western blot测定各组总蛋白中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK、MCP-1和ICAM-1的表达,分别应用硫代巴比妥酸(TAB)法、黄嘌呤氧化酶法、二硫代二硝基苯甲酸法测定细胞上清液中MDA含量和T-SOD、GSH-PX活性,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液中IV型胶原含量。第四部分:取小鼠系膜细胞种植于96孔板,采用MTT法分别检测低糖、高糖以及干预药物缬沙坦在不同时间、不同药物浓度对系膜细胞增殖状态的影响。采用6孔板和25cm2塑料培养瓶培养细胞,将细胞分成3组:LG组(5.5mmol/L葡萄糖);HG组(30mmol/L葡萄糖)和HG+Val组(30mmol/L葡萄糖+10μmol/L缬沙坦),于刺激的48h收集细胞,提取细胞总蛋白及细胞上清液。采用免疫细胞化学和Western blot检测各组总蛋白中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK、MCP-1和ICAM-1蛋白的表达,分别应用硫代巴比妥酸(TAB)法、黄嘌呤氧化酶法、二硫代二硝基苯甲酸法测定细胞上清液中MDA含量和T-SOD、GSH-PX活性,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液中IV型胶原含量。结果:第一部分:①与对照组相比,糖尿病组小鼠肾重/体重从第2周开始升高,Scr和UP从第4周开始明显升高(P<0.05)。②从第2周开始,光镜下观察糖尿病组小鼠肾小球体积稍增大,肾小球内细胞开始增多,基底膜普遍增厚,系膜区基质增多,电镜观察糖尿病组小鼠肾小球基底膜不规则增厚,系膜区增宽,上皮细胞足突融合,12周时上述变化更加显著。③免疫组化染色结果显示,megsin主要表达于肾小球系膜细胞胞浆,p-p38MAPK主要表达于肾小球系膜区、内皮细胞及脏层上皮细胞、近端和远端肾小管上皮细胞,以胞核着色为主,胞浆偶有着色。p38MAPK主要表达于上述细胞胞浆。MCP-1、ICAM-1主要表达于肾小球系膜细胞、内皮细胞及肾小管上皮细胞胞浆,在正常对照组均有少量表达。与对照组相比,糖尿病组megsin及MCP-1、ICAM-1的表达分别从第1、2周开始增强,随着病程的延长而逐渐增强(P<0.05)。p-p38MAPK在糖尿病组2周时表达增强(P<0.05),4周时达高峰(P<0.01),在12周时表达减弱与对照组无差别(P>0.05)。p38MAPK在各组各时间点的表达无明显差异(P>0.05)。④Western blot结果表明,与对照组相比,糖尿病组非磷酸化的p38MAPK蛋白的表达在各时间点无明显差异(P>0.05),而p-p38MAPK在糖尿病2周时表达增强(P<0.05),在第4周时达到最高点(P<0.01),12周时与对照组无差别(P>0.05)。megsin在糖尿病1-12周时表达增强(P<0.05),而MCP-1、ICAM-1在糖尿病2-12周时表达增强(P<0.05)。第二部分:①与对照组相比,第4周时B组小鼠肾重/体重、血糖、血肌酐及24h尿蛋白定量均明显升高(P<0.05);D组上述指标改变更加显著(P<0.05);而E组小鼠指标改变较B组明显减轻(P<0.05);B组和C组之间相比,上述变化无明显差异(P>0.05)。②4周时,光镜观察B组肾小球体积增大,系膜细胞增多,基底膜增厚,细胞外基质增多,电镜观察B组肾小球基底膜不规则增厚,上皮细胞足突融合,内皮细胞窗孔结构消失;D组肾组织的病理改变更加显著;E组肾组织的病理改变则明显得到改善。③免疫组织化学及Western blot结果显示,B组较A组megsin、p-p38MAPK、MCP-1和ICAM-1蛋白的表达明显上调(P<0.01);而与B组相比,D组上述因子的表达进一步增强(P<0.05);E组与B组相比,megsin、p-p38MAPK、MCP-1和ICAM-1蛋白的表达则明显下调(P<0.05);B组和C组之间相比,上述变化无明显差异(P>0.05);非磷酸化p38MAPK在各组的表达均无明显差异(P>0.05)。④与A组相比,B组肾组织中MDA含量上升,T-SOD及GSH-PX活性下降(P<0.01);D组上述改变更显著(P<0.01);而与B组相比,E组MDA含量下降,T-SOD及GSH-PX活性增强(P<0.05)。第三部分:①与A组相比,高糖可促进系膜细胞增殖,并随时间延长更加明显(P<0.01);C组和B组相比差异无统计学意义(P>0.05);与B组相比,D组可进一步促进系膜细胞增殖(P<0.05);而E组与同期B组相比系膜细胞增殖受抑制(P<0.05)。②免疫细胞化学结果显示,megsin、p38MAPK、MCP-1和ICAM-1主要表达于系膜细胞胞浆,p-p38MAPK主要在系膜细胞的胞核中表达,胞浆中仅有少量表达。Western blot结果显示,从12h开始,B组较A组小鼠系膜细胞megsin、p-p38MAPK、MCP-1和ICAM-1表达开始增强,随时间延长增强更加明显,持续到48h(P<0.05);同时间点相比较,C组和B组的差异无统计学意义(P>0.05);D组上述指标的表达强于B组(P<0.05);而E组的表达弱于B组,但仍高于A组(P<0.05)。p38MAPK在各组各时间点的表达均无明显变化(P>0.05)。③细胞上清液检测结果显示,从12h开始,B组与A组相比细胞上清液中MDA及IV型胶原含量开始升高,T-SOD、GSH-PX活性降低,48h MDA及IV型胶原含量达到高峰,T-SOD、GSH-PX活性降至最低(P<0.01);C组和B组相比差异无统计学意义(P>0.05);D组上述变化趋势更显著(P<0.05);E组MDA及IV型胶原含量较同期B组明显减少,但仍高于A组,T-SOD、GSH-PX活性增强,但仍低于A组(P<0.05)。第四部分:①与LG相比,HG组可促进系膜细胞增殖,并随时间延长更加明显(P<0.01);1,10和100μmol/L缬沙坦对高糖培养系膜细胞增殖都有抑制作用,并且随药物浓度的增加抑制作用越明显(P<0.05),100μmol/L缬沙坦出现过度抑制作用(P<0.01)。②免疫细胞化学及Western blot结果显示megsin、p-p38MAPK、MCP-1及ICAM-1在HG组的表达强于LG(P<0.01)组;但缬沙坦组的表达明显弱于HG组(P<0.01)。p38MAPK在各组的表达无明显变化(P>0.05)。③细胞上清液检测结果显示,与LG组相比,HG组细胞上清中MDA及Ⅳ型胶原含量明显增多,T-SOD、GSH-PX活性下降(P<0.01);而缬沙坦组MDA及Ⅳ型胶原含量则明显低于HG组,T-SOD、GSH-PX活性明显高于HG组(P<0.05)。结论:1体内和体外实验证实,糖尿病状态下megsin在肾小球表达增强,伴有肾小球系膜增殖、细胞外基质积聚等肾脏病理改变,提示megsin在糖尿病肾病发生机制中起一定作用。2过表达megsin可上调肾组织或系膜细胞p-p38MAPK、MCP-1、ICAM-1的表达及MDA含量,降低T-SOD、GSH-PX的活性,促进肾小球系膜细胞增生及系膜外基质沉积,提示megsin促发早期糖尿病肾病发生的机制可能与p38MAPK信号通路激活有关,但具体作用途径有待进一步研究阐明。3 megsin siRNA质粒和血管紧张素II受体拮抗剂缬沙坦可分别从基因水平和蛋白水平下调megsin的表达,进而抑制p38MAPK信号通路激活,下调MCP-1、ICAM-1的表达及MDA含量、上调T-SOD、GSH-PX的活性,延缓系膜增殖、细胞外基质积聚病理过程,为人类早期糖尿病肾病的防治提供了新的思路和作用靶点。