论文部分内容阅读
乳腺癌(Breast cancer, BC)发病率和死亡率已跃居全球女性恶性肿瘤的首位。与欧美等发达国家相比，中国等发展中国家的乳腺癌发病表现出发病率较低、患者较年轻、激素受体阴性比例较高等特点。随着肿瘤筛查检测技术的普及和综合治疗水平的提高，乳腺癌患者的预后已取得了显著改善，但乳腺癌仍高居女性恶性肿瘤致死病因的首位，特别是在一些发达国家和地区，乳腺癌更是严重危害女性身心健康的疾病。因此，研究乳腺癌的发生发展，尤其是对侵袭和转移机制的深入研究，为寻找乳腺癌新的分子标记和治疗靶点提供重要的理论依据，具有重大意义。 随着近代肿瘤学的发展，研究已证实肿瘤细胞的无限增殖，进而导致肿瘤细胞的侵袭转移，是肿瘤进展和患者死亡的根本原因。因此，通过研究癌细胞增殖、侵袭和转移，进行乳腺癌生物学行为预测，对肿瘤的预后预测研究具有重要意义。在恶性肿瘤的上皮-间质转化、侵袭、转移及信号传导过程中，Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶(TypeⅡ transmembrane serine protease，TTSPs)起着极其重要的作用。Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶4（TypeⅡ transmembrane serine protease4，TMPRSS4）是TTSPs家族成员之一，多项国内外研究显示了TMPRSS4在多种恶性肿瘤中高表达，比如胃癌、胰腺癌、肝癌和结肠癌等，且与恶性肿瘤的侵袭转移密切相关。近期研究也表明TMPRSS4能够促进肿瘤细胞基底膜(Basement membrane，BM)和细胞外基质(Cell-extracellular matrix，ECM)的降解及组织的重建，通过诱导E-cadherin蛋白表达降低导致上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)的发生来促进肿瘤的侵袭和转移。然而，TMPRSS4在乳腺癌中的表达及与临床生物学行为特征关系的相关性研究极少。本研究通过观察乳腺癌组织及正常乳腺组织中TMPRSS4蛋白的表达，探讨其与乳腺癌临床病理学特征及预后的关系;通过体外实验，检测乳腺癌细胞系中TMPRSS4 mRNA和蛋白水平的表达，观察TMPRSS4表达对乳腺癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的调控，并初步探究其潜在的作用机制。本课题主要包括以下两个部分: 第一部分 TMPRSS4在乳腺癌组织中的表达及其与临床病理特征和预后的相关性研究 目的:通过检测Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶4（TMPRSS4）蛋白在乳腺癌组织及正常乳腺组织中的表达情况，探讨其与乳腺癌临床病理学特征及预后的关系。 方法:采用免疫组织化学(Immunohistochemical，IHC)方法检测107例乳腺癌石蜡包埋组织及52例正常乳腺组织中TMPRSS4蛋白的表达，分析TMPRSS4表达与乳腺癌临床病理特征及患者总生存期(Overall survival，OS)及无病生存期（Disease free survival，DFS）的关系，探讨TMPRSS4对乳腺癌患者预后的影响。 结果:(1)107例乳腺癌标本中TMPRSS4高表达者70例(70/107)，表达率为65.4％，而在正常乳腺组织中TMPRSS4表达率为17.6％(9/52)，两者比较有显著的统计学差异(P＜0.05)，且TMPRSS4的表达强度随着乳腺浸润性导管癌组织学分级的升高而升高。(2) TMPRSS4的高表达与肿瘤大小(P=0.044)、浸润性导管癌组织学分级(P=0.006)、淋巴结转移(P=0.002)、临床分期(P=0.015)有关，而与年龄、月经状态、乳腺癌组织学类型及ER、PR、HER-2的表达情况均无明显相关，差异无统计学意义（均P＞0.05）。(3) KaPlan-Meier生存分析并经Log-rank检验，结果显示TMPRSS4蛋白高表达组生存率低于低表达组，差异具有显著统计学意义(OS，P=0.036; DFS，P=0.010)。(4)单因素分析显示肿瘤大小(OS，P=0.042; DFS，P=0.047)、淋巴结转移(OS，P=0.000; DFS，P=0.001)、浸润性导管癌组织学分级(OS，P=0.036; DFS，P=0.039)、临床分期(OS，P=0.009;DFS，P=0.012)和TMPRSS4的表达(OS，P=0.015; DFS，P=0.018)均与预后相关。多因素分析显示TMPRSS4的表达(OS，P=0.016; DFS，P=0.019)及淋巴转移(OS，P=0.001;DFS，P=0.002)和临床分期(OS，P=0.015;DFS，P=0.018)是影响乳腺癌预后的独立因素。 结论:(1) TMPRSS4在乳腺癌组织中高表达。(2) TMPRSS4高表达与乳腺癌的肿瘤大小、浸润性导管癌组织学分级、淋巴结转移和临床分期密切相关，可能促进乳腺癌的发展。(3) TMPRSS4高表达的肿瘤患者生存时间更短，预后更差。TMPRSS4高表达是评估乳腺癌患者预后的独立风险因素。(4)总之，TMPRSS4可能成为治疗乳腺癌的新的治疗靶点。 第二部分 TMPRSS4在乳腺癌细胞侵袭和转移中的调控作用及与上皮-间质转化的关系 目的:通过检测乳腺癌细胞中TMPRSS4表达情况，分析其在乳腺癌细胞增殖、转移和侵袭过程中的作用及其与上皮-间质转化(Epithelial-MesenchymalTransition，EMT)的关系，并探讨TMPRSS4表达在乳腺癌发生发展过程中的作用与意义。 方法:(1)采用实时荧光定量PCR(Real time quantitive polymerase chainreaction，RT-qPCR)和Western blot法检测本课题组已有的5种乳腺癌细胞系(MCF-7、MCF-7/ADM、T47D、MDA-MB-231和MDA-MB-468)中TMPRSS4mRNA和蛋白水平的表达情况。 (2)提取pCMV-myc-TMPRSS4过表达质粒，将其转染至乳腺癌细胞系MDA-MB-468和MDA-MB-231，采用RT-qPCR方法检测转染效率，并通过MTS和EdU细胞增殖实验、Transwell和Matrigel细胞迁移和侵袭实验，研究TMPRSS4过表达调控乳腺癌增殖、迁移和侵袭的作用。 (3)将TMPRSS4的小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)瞬时转染至乳腺癌细胞系MDA-MB-468和MDA-MB-231，通过RT-qPCR评估其干扰效率，采用MTS和EdU细胞增殖实验、Transwell和Matrigel细胞迁移和侵袭实验，研究TMPRSS4表达抑制调控乳腺癌增殖、迁移和侵袭的作用。 (4)采用RT-qPCR和Western blot法检测过表达和抑制TMPRSS4后细胞EMT相关基因E-cadherin、Vimentin、Claudin-1、Slug、ZEB1的表达变化。 结果:(1) RT-qPCR和Western blot显示，TMPRSS4 mRNA和蛋白在5种乳腺癌细胞系中均有表达，以MDA-MB-468细胞系表达最高，MDA-MB-231细胞系表达次之。过表达质粒测序符合实验要求，检测过表达和干扰效率均符合实验要求。(2)MTS和EdU实验显示TMPRSS4过表达组乳腺癌细胞MDA-MB-468和MDA-MB-231的增殖率明显增加（均P＜0.05）;反之，沉默TMPRSS4的表达乳腺癌细胞的增殖率显著下降（均P＜0.05）。(3)Transwell小室和Matrigel实验显示，TMPRSS4过表达组中两种乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力显著升高;反之，降低TMPRSS4表达水平乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力显著下降（均P＜0.05）。(4)过表达TMPRSS4后，EMT相关基因包括上皮性标记E-cadherin和Claudin-1的表达均显著下降，而间质标记Vimentin和Slug的表达均明显提高(P＜0.05)。转染TMPRSS4 siRNA后，乳腺癌细胞E-cadherin和Claudin-1的表达均显著升高，而Vimentin和Slug的表达均明显降低(P＜0.05)。 结论:(1) TMPRSS4在乳腺癌MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞系中高表达。(2) TMPRSS4过表达能够促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而干扰TMPRSS4表达能够抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。(3)上调或下调TMPRSS4的表达，能够调控乳腺癌细胞EMT相关基因的表达，TMPRSS4可能参与了乳腺癌EMT的发生过程。