TMPRSS4表达在调控乳腺癌侵袭转移中的作用及相关机制研究

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乳腺癌(Breast cancer, BC)发病率和死亡率已跃居全球女性恶性肿瘤的首位。与欧美等发达国家相比,中国等发展中国家的乳腺癌发病表现出发病率较低、患者较年轻、激素受体阴性比例较高等特点。随着肿瘤筛查检测技术的普及和综合治疗水平的提高,乳腺癌患者的预后已取得了显著改善,但乳腺癌仍高居女性恶性肿瘤致死病因的首位,特别是在一些发达国家和地区,乳腺癌更是严重危害女性身心健康的疾病。因此,研究乳腺癌的发生发展,尤其是对侵袭和转移机制的深入研究,为寻找乳腺癌新的分子标记和治疗靶点提供重要的理论依据,具有重大意义。  随着近代肿瘤学的发展,研究已证实肿瘤细胞的无限增殖,进而导致肿瘤细胞的侵袭转移,是肿瘤进展和患者死亡的根本原因。因此,通过研究癌细胞增殖、侵袭和转移,进行乳腺癌生物学行为预测,对肿瘤的预后预测研究具有重要意义。在恶性肿瘤的上皮-间质转化、侵袭、转移及信号传导过程中,Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶(TypeⅡ transmembrane serine protease,TTSPs)起着极其重要的作用。Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶4(TypeⅡ transmembrane serine protease4,TMPRSS4)是TTSPs家族成员之一,多项国内外研究显示了TMPRSS4在多种恶性肿瘤中高表达,比如胃癌、胰腺癌、肝癌和结肠癌等,且与恶性肿瘤的侵袭转移密切相关。近期研究也表明TMPRSS4能够促进肿瘤细胞基底膜(Basement membrane,BM)和细胞外基质(Cell-extracellular matrix,ECM)的降解及组织的重建,通过诱导E-cadherin蛋白表达降低导致上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)的发生来促进肿瘤的侵袭和转移。然而,TMPRSS4在乳腺癌中的表达及与临床生物学行为特征关系的相关性研究极少。本研究通过观察乳腺癌组织及正常乳腺组织中TMPRSS4蛋白的表达,探讨其与乳腺癌临床病理学特征及预后的关系;通过体外实验,检测乳腺癌细胞系中TMPRSS4 mRNA和蛋白水平的表达,观察TMPRSS4表达对乳腺癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的调控,并初步探究其潜在的作用机制。本课题主要包括以下两个部分:  第一部分 TMPRSS4在乳腺癌组织中的表达及其与临床病理特征和预后的相关性研究  目的:通过检测Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶4(TMPRSS4)蛋白在乳腺癌组织及正常乳腺组织中的表达情况,探讨其与乳腺癌临床病理学特征及预后的关系。  方法:采用免疫组织化学(Immunohistochemical,IHC)方法检测107例乳腺癌石蜡包埋组织及52例正常乳腺组织中TMPRSS4蛋白的表达,分析TMPRSS4表达与乳腺癌临床病理特征及患者总生存期(Overall survival,OS)及无病生存期(Disease free survival,DFS)的关系,探讨TMPRSS4对乳腺癌患者预后的影响。  结果:(1)107例乳腺癌标本中TMPRSS4高表达者70例(70/107),表达率为65.4%,而在正常乳腺组织中TMPRSS4表达率为17.6%(9/52),两者比较有显著的统计学差异(P<0.05),且TMPRSS4的表达强度随着乳腺浸润性导管癌组织学分级的升高而升高。(2) TMPRSS4的高表达与肿瘤大小(P=0.044)、浸润性导管癌组织学分级(P=0.006)、淋巴结转移(P=0.002)、临床分期(P=0.015)有关,而与年龄、月经状态、乳腺癌组织学类型及ER、PR、HER-2的表达情况均无明显相关,差异无统计学意义(均P>0.05)。(3) KaPlan-Meier生存分析并经Log-rank检验,结果显示TMPRSS4蛋白高表达组生存率低于低表达组,差异具有显著统计学意义(OS,P=0.036; DFS,P=0.010)。(4)单因素分析显示肿瘤大小(OS,P=0.042; DFS,P=0.047)、淋巴结转移(OS,P=0.000; DFS,P=0.001)、浸润性导管癌组织学分级(OS,P=0.036; DFS,P=0.039)、临床分期(OS,P=0.009;DFS,P=0.012)和TMPRSS4的表达(OS,P=0.015; DFS,P=0.018)均与预后相关。多因素分析显示TMPRSS4的表达(OS,P=0.016; DFS,P=0.019)及淋巴转移(OS,P=0.001;DFS,P=0.002)和临床分期(OS,P=0.015;DFS,P=0.018)是影响乳腺癌预后的独立因素。  结论:(1) TMPRSS4在乳腺癌组织中高表达。(2) TMPRSS4高表达与乳腺癌的肿瘤大小、浸润性导管癌组织学分级、淋巴结转移和临床分期密切相关,可能促进乳腺癌的发展。(3) TMPRSS4高表达的肿瘤患者生存时间更短,预后更差。TMPRSS4高表达是评估乳腺癌患者预后的独立风险因素。(4)总之,TMPRSS4可能成为治疗乳腺癌的新的治疗靶点。  第二部分 TMPRSS4在乳腺癌细胞侵袭和转移中的调控作用及与上皮-间质转化的关系  目的:通过检测乳腺癌细胞中TMPRSS4表达情况,分析其在乳腺癌细胞增殖、转移和侵袭过程中的作用及其与上皮-间质转化(Epithelial-MesenchymalTransition,EMT)的关系,并探讨TMPRSS4表达在乳腺癌发生发展过程中的作用与意义。  方法:(1)采用实时荧光定量PCR(Real time quantitive polymerase chainreaction,RT-qPCR)和Western blot法检测本课题组已有的5种乳腺癌细胞系(MCF-7、MCF-7/ADM、T47D、MDA-MB-231和MDA-MB-468)中TMPRSS4mRNA和蛋白水平的表达情况。  (2)提取pCMV-myc-TMPRSS4过表达质粒,将其转染至乳腺癌细胞系MDA-MB-468和MDA-MB-231,采用RT-qPCR方法检测转染效率,并通过MTS和EdU细胞增殖实验、Transwell和Matrigel细胞迁移和侵袭实验,研究TMPRSS4过表达调控乳腺癌增殖、迁移和侵袭的作用。  (3)将TMPRSS4的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)瞬时转染至乳腺癌细胞系MDA-MB-468和MDA-MB-231,通过RT-qPCR评估其干扰效率,采用MTS和EdU细胞增殖实验、Transwell和Matrigel细胞迁移和侵袭实验,研究TMPRSS4表达抑制调控乳腺癌增殖、迁移和侵袭的作用。  (4)采用RT-qPCR和Western blot法检测过表达和抑制TMPRSS4后细胞EMT相关基因E-cadherin、Vimentin、Claudin-1、Slug、ZEB1的表达变化。  结果:(1) RT-qPCR和Western blot显示,TMPRSS4 mRNA和蛋白在5种乳腺癌细胞系中均有表达,以MDA-MB-468细胞系表达最高,MDA-MB-231细胞系表达次之。过表达质粒测序符合实验要求,检测过表达和干扰效率均符合实验要求。(2)MTS和EdU实验显示TMPRSS4过表达组乳腺癌细胞MDA-MB-468和MDA-MB-231的增殖率明显增加(均P<0.05);反之,沉默TMPRSS4的表达乳腺癌细胞的增殖率显著下降(均P<0.05)。(3)Transwell小室和Matrigel实验显示,TMPRSS4过表达组中两种乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力显著升高;反之,降低TMPRSS4表达水平乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力显著下降(均P<0.05)。(4)过表达TMPRSS4后,EMT相关基因包括上皮性标记E-cadherin和Claudin-1的表达均显著下降,而间质标记Vimentin和Slug的表达均明显提高(P<0.05)。转染TMPRSS4 siRNA后,乳腺癌细胞E-cadherin和Claudin-1的表达均显著升高,而Vimentin和Slug的表达均明显降低(P<0.05)。  结论:(1) TMPRSS4在乳腺癌MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞系中高表达。(2) TMPRSS4过表达能够促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而干扰TMPRSS4表达能够抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。(3)上调或下调TMPRSS4的表达,能够调控乳腺癌细胞EMT相关基因的表达,TMPRSS4可能参与了乳腺癌EMT的发生过程。
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