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作为主要的钠离子(Na+)外排系统,钠离子/质子逆向转运蛋白(Na+/H+antiporters,NHAs)也是细菌中对Na+胁迫适应性应答的主要系统。NHAs是一种次级钠泵系统,于1974年在大肠杆菌中首次报道,广泛分布于细菌、古细菌、真菌、植物、动物、哺乳动物乃至人类细胞内。NHAs位于细胞质膜上,是一种跨膜蛋白,它可以利用初级质子泵,如ATPase(F0F1)和呼吸链产生的跨膜质子电化学梯度为动力,向膜外转运Na+,同时将H+转运回膜内,从而维持胞内相对较低的Na+浓度。
目前结构和功能研究最为深入的NHAs是大肠杆菌Ec-NhaA,也是大肠杆菌等肠道细菌针对Na+及Na+存在条件下碱性pH产生适应性应答的主要系统。NhaA蛋白家族存在于许多细菌和古细菌中,其主要特点是活性具有高度pH依赖性。Ec-nhaA基因的转录受其下游基因Ec-nhaR的调控,后者属于LysR蛋白家族。Ec-NhaR能与Ec-nhaA基因的上游DNA序列结合,从而抑制Ec-nhaA基因的转录。但当Na+存在时,与Na+结合的Ec-NhaR发生了蛋白构象的改变,影响了Ec-NhaR与两个关键位点G-60和G-92的结合,从而促进Ec-nhaA基因的转录。因此,Ec-NhaR既是Na+信号的感受器,又是Na+信号的传导器,从而高效地调控Ec-nhaA基因的表达。
粘细菌(Myxobacteria)是一类革兰氏阴性滑动细菌,具有复杂的多细胞行为,如生长的细胞密度依赖性,群体捕食,子实体发育以及在不良环境中分化形成粘孢子。课题组前期在Myxococcus xanthus DK1622的基因组中发现了2个预测为Na+/H+ antiporter NhaA的基因MXAN_3898和MXAN_6055,它们的敲除导致突变株在Na+条件下的生长显著下降,提示其可能在该菌株的盐胁迫应答中发挥作用。本论文在此基础上,深入研究了MXAN_6055基因产物可能的NhaA活性,并且对其转录调控机制进行了初步探索。
首先围绕上述基因构建了一系列突变体,通过对其在盐胁迫条件下的生长、运动、发育等性质的分析,证明了MXAN_6055基因确实在M.xanthus DK1622的盐胁迫应答生长中发挥作用。MXAN_6055敲除突变株YL1012在NaCl或LiCl胁迫下的生长显著降低,如在200 mM NaCl胁迫下的生长较野生株下降了51%;当将该基因再回补到YL1012中时,其生长缺陷得到了恢复,从而证实上述M.xanthus突变株在NaCl或LiCl胁迫下的生长缺陷是由MXAN6055基因引起的。但是,MXAN_6055基因的过表达并没有导致菌株耐盐生长的显著提高,暗示MXAN_6055基因在细胞内存在转录调控机制或者更高水平的调控机制。
其次,利用大肠杆菌Na+/H+ antiporters缺陷菌株KNabc进一步鉴定了MXAN_6055基因产物的NhaA活性。将MXAN_6055基因异源表达到KNabc菌株中,可使其在碱性条件下(pH7.0-8.0)的Na+和Li+耐受能力从完全敏感分别提高到600mM和100mM。利用高压破碎法制备了上述菌株的反转膜泡(evertedmembrane vesicles,EM Vs),并利用吖啶橙荧光淬灭-恢复实验检测了其Na+(Li+)逆转运活性。结果表明EMVs在pH7.0和8.0时均具有Na+转运活性,且在pH7.0时的转运活性高于pH8.0时。以上结果证明了MXAN_6055蛋白确实具有Na+(Li+)耐受性和NhaA活性。
最后,对MXAN_6055基因的转录调控机制进行了研究。以E.coli中Ec-NhaA的转录调控因子NhaR为提问序列,通过同源性检索在M.xanthus DK1622基因组中检索到其可能的同源基因MXAN_0784,两者的氨基酸序列一致性为34%。通过突变体构建及性质分析表明,与野生菌株M.xanthusDK1622相比,MXAN_0784的敲除导致突变株Na+胁迫下生长能力的降低,而其过表达则导致相应条件下生长能力的提高;qRT-PCR的检测结果与突变体性质分析结果一致,即:MXAN_0784敲除突变株中MXAN_6055基因的转录水平下降,而其过表达突变株中MXAN_6055基因的表达水平显著提高,表明MXAN_0784基因对MXAN_6055基因的转录具有正调控作用。将MXAN_0784进行异源表达并纯化后,利用bandshift试验验证了其与MXAN_6055基因上游调控序列的特异性结合能力。以上结果证明了MXAN_0784作为MXAN_6055基因的正转录调控因子,调控了后者在粘球菌盐胁迫应答中的NhaA活性。