膜联蛋白是一类钙依赖性磷脂结合蛋白，形成进化上保守的多基因家族，在动、植物中广泛表达。在细胞各种生理功能中起重要作用。膜联蛋白A1(AnnexinA1，简称AnxA1)是哺乳动物膜联蛋白家族中的一个重要成员，它与细胞增殖、分化、信号传递、炎症等密切相关，前期研究已发现它在精子中亦有表达，并呈区域性分布，推测与精子的一系列钙依赖事件如运动、顶体反应过程中的膜融合、受精过程中的精卵相互作用等有关。但目前它在生殖系统中的作用尚不明确，在睾丸中的表达定位尚未见报道，对其在精子中的定位研究还相当有限，且还未见关于它在精子中功能的较为直接的研究。本文以小鼠为实验对象，研究AnxA1在出生后不同发育时期睾丸中的表达与定位，以期了解它与睾丸出生后发育及精子发生的关系；同时，对处于不同成熟阶段及不同生理功能状态的精子进行AnxA1定位。此外，制备了AnxA1多克隆抗体并探讨AnxA1与体外受精的关系。本研究旨在为阐明AnxA1在生殖系统中的作用奠定一定的基础，可望为哺乳动物及人类受精机制的研究提供一定的理论依据，从而为辅助生殖技术、不育症诊疗与计划生育提供一定的理论指导。本实验分三部分。 1.膜联蛋白A1在小鼠睾丸不同发育阶段的表达与定位 对1～8周龄小鼠睾丸进行AnxA1间接免疫组化染色及半定量RT-PCR以研究AnxA1的表达水平及其定位。结果显示：AnxA1在各级生精细胞中均有表达。其中精原细胞染色最强，主要分布在细胞核内；初级精母细胞多为弱阳性或阴性；圆形精子细胞AnxA1分布在细胞一侧顶体泡、顶体帽中，精子的AnxA1分布在顶体中。精子形成后留下的残余体亦呈强阳性染色。支持细胞未见明显阳性染色。对1、2、3、4、5、6、8周龄小鼠睾丸AnxA1免疫组化染色阳性强度即平均积分光密度进行图像分析结果分别是：2.94±0.36，8.53±0.90，7.32±1.22，6.87±0.51，5.59±0.53，4.53±0.38，4.64±0.40，单因素方差分析结果显示1、2、5周龄组的AnxA1免疫组化染色强度与其余各组均存在显著性差异(P＜0.01)，3周龄与4周龄间(P=0.26，＞0.05)、6周龄与8周龄间(P=0.78，＞0.05)无显著性差异，它们与其余组间存在显著性差异(P＜0.01)。显示AnxA1蛋白在1周龄小鼠睾丸中表达较低，2周龄后表达升高并达到峰值，而后逐渐下降，至6～8周趋于平稳。对AnxA1mRNA进行半定量RT-PCR，以β-actin为内参照，表达强度分别是：0.87±0.09，1.94±0.16，1.66±0.10，1.60±0.09，1.38±0.05，116±0.1，1.10±0.06，单因素方差分析结果显示1、2、5周龄组的AnxA1mRNA水平与其余各组均存在显著性差异(P＜0.01)，3周龄与4周龄间(P=0.36，＞0.05)、6周龄与8周龄间无显著性差异(P=0.35，＞0.05)，它们与其余组间存在显著性差异(P＜0.01)。结果表明AnxA1蛋白及mRNA在小鼠睾丸的表达水平出现加龄变化，其变化趋势相似。提示AnxA1与小鼠生精细胞的增殖分化以及睾丸出生后发育成熟有关。 2.膜联蛋白A1在小鼠精子中的定位 用间接免疫荧光染色对取自小鼠生精管道中不同部位的精子以及处于不同生理状态的精子进行AnxA1定位，以期了解AnxA1与精子睾丸后成熟、获能、项体反应的关系。发现取自睾丸、附睾头、体、尾部的精子AnxA1均分布于项体帽区及尾部，不同部位的精子AnxA1分布无明显差别。对诱导获能、顶体反应的精子进行AnxA1免疫荧光定位发现根据头部荧光分布特点分为2种类型：项体帽区标记型(Acrosomalcap)，简称“Cap"型；赤道段-顶体后区标记型(Equatorialsegment-postacrosomalarea，Ep)，简称“Ep"型。获能培养组的精子"Cap"型百分率为97.3±1.04％，“Ep"型为2.7±1.04％；诱导项体反应组的精子"Cap"型百分率为41.8±4.09％，“Ep"型为58.2±4.09％。同时用考马斯亮蓝染色鉴定精子顶体反应率，发现获能培养组顶体完整的精子百分率为94.6±2.51％，顶体反应率为5.4±2.51％；诱导顶体反应组顶体完整的精子百分率为353±3.68％，项体反应率为64.7±3.68％。结果表明AnxAl荧光"Cap"型百分率与考马斯亮蓝染色鉴定的顶体完整的精子百分率相近，“Ep"型与项体反应的精子百分率相近。用胶体金间接免疫电镜技术对诱导获能、顶体反应的精子进行AnxAl定位发现，顶体反应初期精子胶体金标记主要表现为"Cap"型，而项体反应后期接近完成时主要表现为“Ep”型，分布区域与免疫荧光定位结果类似。项体完整的精子未见胶体金标记。综合光电镜结果，提示获能后精子AnxAl分布无明显变化，仍分布于顶体帽区及尾部；而项体反应后的精子，AnxAl主要分布于赤道段及顶体后区。 3.膜联蛋白A1与小鼠体外受精的关系 首先利用RT-PCR技术克隆了小鼠睾丸全长AnxAlcDNA，将其与表达载体pGEX-5T质粒连接，转化大肠杆菌并用0.8mmol/L的IPTG诱导其表达。利用GST亲和层析柱纯化融合蛋白GST-AnxAl，并用凝血酶切除GST，将纯AnxA1蛋白免疫家兔，获得抗血清并初步纯化免疫球蛋白，ELISA检测AnxA1抗血清效价，Western-Blot检测抗血清的特异性。结果显示，RT-PCR产物电泳可见1041bp的片段，与预期片段长度一致，测序结果与小鼠AnxA1cDNA序列完全一致；融合蛋白GST-AnxA1在细菌中高效表达，蛋白产量约占菌体蛋白总量的30％，主要为可溶性形式。融合蛋白经亲和层析纯化后电泳可见63KD的条带，与预期分子量相符，纯度达90％以上；用凝血酶除去GST，电泳可见37KD的条带，与预期AnxA1分子量相符。免疫家兔后用ELISA检测AnxA1抗血清效价达1：47，Western-Blot检测AnxA1抗血清特异性，发现AnxA1抗血清可特异结合重组AnxA1。同时研究了AnxA1多抗对小鼠体外受精的影响。用制备的兔抗小鼠AnxA1多抗处理获能前及获能后小鼠精子，并进行体外受精实验，以阴性兔血清为对照，以受精率为指标，研究AnxA1多抗对精子穿含透明带卵及去透明带卵有否影响。结果显示AnxA1多抗处理获能前精子，含透明带卵受精率为67.47±9.14％，阴性对照组为64.39±7.99％；去透明带卵受精率为85.48±5.51％，阴性对照组为87.67±4.71％。AnxA1多抗处理获能后精子，含透明带卵受精率为70.79±4.51％，阴性对照组为74.07±7.06；去透明带卵受精率为86.09±3.94，阴性对照组为88.15±577。方差分析结果显示AnxA1多抗处理组与阴性对照组之间均无显著性差异(P＞0.05)。表明AnxA1多抗对精子穿透含透明带卵及去透明带卵均无明显影响。 结论: 1膜联蛋白A1在小鼠睾丸中的表达具有时空变化规律，可能与小鼠生精细胞的增殖分化及睾丸出生后发育成熟有关。 2取自小鼠生精管道中不同部位的精子AnxA1均分布于项体帽区及尾部，不同部位的精子AnxA1分布无明显差别。获能后精子AnxA1分布无明显变化，顶体反应后AnxA1主要分布于赤道段及顶体后区。 3成功克隆、表达了AnxA1重组蛋白并制备了多抗；AnxA1多抗对精子穿卵无明显影响。AnxA1可能并非精卵相互作用的关键受体。