RNA干扰介导肌肉环指蛋白-1(MuRFl)基因下调延缓失神经骨骼肌萎缩的基础研究

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目的:应用RNA干扰技术体外抑制大鼠MuRF1基因表达的效果,以期筛选出针对MuRF1基因抑制效果最佳的siRNA重组质粒。  方法:根据大鼠MuRF1基因的mRNA序列,设计四组干扰序列,即siRNAMuRF1-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ,利用lipofactamine2000转染试剂将siRNA重组质粒转染大鼠成肌细胞系L6,于转染后48h与72h,采用实时定量PCR和Westernblot或免疫印迹检测其对MuRF1表达的抑制效果。  结果:1.实时定量PCR显示四组干扰质粒MuRF1Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ对基因MuRF1的mRNA的抑制率在转染后48h分别为67﹪、31﹪、11﹪,20﹪,不同干扰序列的抑制效果有差异(F=4.527,P=0.024);72h分别为79﹪、59﹪、50﹪和61﹪,不同干扰序列的抑制效果有差异(F=19.088,P<0.001),与48h相比,抑制效应更为明显,但以siRNAMuRF1-Ⅰ的抑制效果最为明显(t=8.201,P<0.001)。2.使用Western印迹灰度分析显示四组干扰序列对基因MuRF1的蛋白的抑制率在转染后48h分别为61﹪、40﹪、9﹪,15﹪,不同干扰序列的抑制效果有差异(F=4.286,P=0.028);72h分别为70﹪、54﹪、30﹪,46﹪,不同干扰序列的抑制效果有差异(F=3.731,P=0.042);与48h相比,MuRFl-Ⅰ、MuRFl-Ⅱ抑制效应与对照组相比有显著性差异(tⅠ=3.256,P=0.009;t=2.512,P=0.03),但MuRFl-Ⅲ和MuRFl-Ⅳ与对照组相比仍无显著性差异(P>0.05)。四对序列中,以siRNAMuRF1-Ⅰ的抑制效果最为明显。蛋白水平的抑制效果与mRNA水平基本一致。  结论:成功筛选出对MuRF1基因有效的siRNA重组质粒,即siRNAMuRF1-Ⅰ,为后期利用RNA干扰技术研究MuRF1基因的功能和治疗骨骼肌萎缩奠定基础。
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