游离小孢子培养技术在植物育种以及相关的基础研究中具有广阔的应用前景,近年来这一技术在芸薹属植物中得到迅速发展。为了进一步完善大白菜游离小孢子培养体系,本试验以不同胚诱导能力的基因型大白菜为试材,针对培养体系中的预处理方法、胚胎移植成苗培养方法等进行了新的尝试与改良;通过细致的显微观察,对大白菜小孢子离体培养过程中的胚胎发生和自然加倍机理进行研究与探讨。 大白菜小孢子提取过程中进行短期的预处理,增加B5提取培养基的蔗糖浓度、添加适当浓度的甘露醇不会影响小孢子的活力,却潜在影响了后期小孢子培养的脱分化,明显提高了离体小孢子培养的胚胎诱导率。B5提取培养基两组处理中,蔗糖浓度为17%和甘露醇浓度8%的处理效果最好,各材料每皿平均出胚量与对照相比都达到极显著水平。参试的9份材料显示两组处理都有效的提高了大白菜小孢子的出胚量,但大白菜基因型仍然是影响小孢子胚胎发生的主要因素。 大白菜小孢子子叶期胚移植成苗实验表明,子叶期胚直接转入B5固体培养基进行25℃/16h光照培养,大多数胚状体子叶变肥厚,愈伤化,往往要通过二次分化才能发育为正常植株。对5份参试材料培养的子叶期胚进行4℃低温前处理,低温处理虽然不能完全克服大白菜不同基因型子叶期胚向植株移植培养的差异,但能有效降低培养过程胚的死亡率,与对照相比都不同程度提高了胚状体的成苗率,同时大部分子叶期胚能不经过二次分化而快速的生长为正常植株。比较各处理8周的培养结果,4℃低温10天处理与对照相比在子叶期胚的成苗率和死亡率上都达到最佳效果。 通过显微观察,诱导适期的大白菜小孢子是成功获得胚状体的前提,单核靠边期小孢子经热激诱导启动的标志是圆球型小孢子体积明显膨大,同时观察到细胞核发生自然加倍,单核小孢子变为二倍体的单细胞。说明大白菜小孢子在培养初期就可能完成胚胎的自然加倍。显微观察发现热激诱导启动下,大白菜小孢子的胚胎发育途径是几种方式并存的,但以B途径为主要发育途径,此外还存在少量的A途径发育和不对称分裂的细胞团。启动后以B途径为主要发育途径的大白菜小孢子离体培养48小时发生第一次细胞分裂,形成两个对称的子细胞,离体培养72小时发生第二次细胞分裂,形成对称的四细胞团,之后细胞团继续对称分裂最终形成胚状体。