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造血干细胞移植已广泛应用于治疗恶性血液疾病，骨髓增生异常综合症以及那些因接受了大剂量化疗而需要造血支持的恶性肿瘤病人。但造血干细胞数量极其稀少，因此许多人都试图通过离体的手段扩增造血干细胞，而研究发现造血干细胞体外扩增与保持其多向分化潜能之间往往产生矛盾。造血干细胞在体外培养时进入细胞周期使其其归巢能力及长期重建造血能力明显降低。造血干细胞的体外维持，即使造血干细胞处于细胞周期之外，从而保持其自我更新及多向分化潜能，对于造血干细胞移植等临床应用至关重要。 最近发现的一种植物凝集素FRIL（Flt3 receptor-interacting lectin），能够于离体条件下长期维持造血干细胞的自我更新能力。FRIL能够特异地结合造血干／祖细胞上的Flt3受体，通过RTK信号传导途径，调整细胞周期相关蛋白的表达及作用方式，在一定程度上将造血干／祖细胞滞留于G0／G1期，达到体外长期维持造血干／祖细胞自我更新和多向分化潜能的效果。我们研究小组从眉豆（Dolichos lablab）中分离得到凝集素FRIL，其具有凝集特性和糖结合特异性。体外维持培养脐血CD34+细胞的实验证实，FRIL具有延长造血干细胞的细胞周期，减少进入分裂和增殖过程的细胞数，抑制前体细胞分化，长期维持造血干／祖细胞多向分化潜能特征。但是其维持造血干祖细胞静息的机制目前还不清楚，因此本文从细胞周期调控的角度对这一问题进行了探讨。FL（Flt3 ligand）具有和FRIL相同的受体Flt3，是目前最常用的体外维持造血干细胞的细胞因子之一，但它同样可诱导静息的干细胞进行增殖与分化，导致具重建功能的干细胞减少。在实验中，我们选择以FL为对照研究FRIL维持造血干／祖细胞过程中的细胞周期调控机制。 参与细胞周期G0／G1期调控的因子大致可以分为三类：Cyclin（细胞周期素）、CDK（细胞周期素依赖性激酶）、CKI（细胞周期素依赖性激酶抑制剂）。其中Cyclin和CDK是细胞周期G0／G1期进程的正向调节子，Cyclin呈周期时相性表达，Cyclin与相应的CDK形成复合物激活CDK，当复合物的活性达到一定程度时就能够通过G1／S期限制点，推动细胞周期向S期转换。而CKI通过在G1／S期限制点抑制CDK的活性，从而对细胞周期进程起到负调控作用。为了探讨FRIL体外维持造血干／祖细胞的可能机制，本实验对参与细胞周期调控，尤其是参与G0／G1期细胞周期调控的多种因子进行了mRNA水平及蛋白水平的研究。其中包括参与G0／G1期细胞周期调控的CDK4、CKD6；CyclinD1、CyclinD2、CyclinD3和CyclinE；CKI如P21、P27、硕士学位论文英文摘要P16等，以及其它一些与细胞周期调控密切相关的因子，够通过激活PZI或其它CKI的表达引起细胞周期停滞，调节细胞周期进程。分别以FRIL、FL和不添加因子的空白对照3组培养脐血CD34十细胞，于培养的不同时间提取细胞的总RNA和总蛋白，以RT-PCR方法检测目的mRNA的表达，以W七stem Blot方法检测培养0d、3d时三组细胞中目的蛋白的表达。 结果显示F班L维持培养的CD34+细胞Cychn、CDK的 mRNA及蛋白的表达与对照组有差异，同添加FRJL、FL维持培养的CD34+细胞的增殖及细胞周期分析结果相吻合:F租L组增殖速度最慢，其Cyclln的mRNA表达量最低，高峰时相出现最晚;FL组增殖速度最快，Cychn的mRNA表达量最高，高峰时相出现最早;空白对照组增殖速度居中，Cyclin的mRNA表达量及时相也居中。Westem Blot实验证明，在0d时，即静止的CD34+细胞中未检测到eyeli山l、Cyeli心3、Cn以、eoK6蛋白的表达，3d时F租L组Cyclin D3、CDK6蛋白表达低于两个对照组，这也与细胞增殖分析结果相吻合，并且同文献报道的造血细胞中主要表达CyclinD3、CDK6相符。推测F租L调节了参与造血干/祖细胞GO/GI期调控的Cyclin及CDK，使其处于较低表达水平，从而抑制细胞周期进程。 P21可抑制造血干细胞进入细胞周期，维持干细胞的稳定。P27缺陷对造血干细胞的数量，细胞周期及自我更新均没有影响，但是造血祖细胞的增殖和数量明显升高。同时，PZI和P27在造血细胞的分化过程中也发挥重要作用，参与诱导分化过程中的周期阻滞。在培养开始的8h，p21 mRNA就出现了一个明显上调，反映了Flt3表达阳性的细胞受其配体F班L的刺激，激活了下游的信号通路，而某些或某个转录因子的激活上调了pZI mRNA的表达。培养3d时FRJL组p27蛋白表达量低于空白对照组，FL组的表达量最高，又因为三组细胞的分化研究结果认为F班L抑制了造血干/祖细胞分化，所以推测p27在FRIL抑制造血干/祖细胞分化过程中发挥了重要作用。WTI具有维持造血干细胞静息状态，保持干细胞特性的作用。相关的实验证实WTI的表达在开始培养的4h出现一个明显的升高，与本实验中P218h的上调表达相对应，说明早期pZI的转录可能是被WTI激活的。但是与pZI一致，WTI在培养过程中也一直保持较低水平，说明它也不参与F租L对造血干/祖细胞的维持。p53作为转录因子，可诱导多种基因的表达。通过激活pZI或其它CKI的表达，p53可引起细胞周期停滞;而通过促进原凋亡基因Bax，FaS的表达则引起细胞凋亡。何时发挥何种调节作用由多种因素共同决定，包括胞内p53蛋白的表