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目的本课题以初发类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)病人和胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis,CIA)小鼠模型为研究对象,检测RA患者外周血滤泡辅助性T细胞(Follicular helper T cells,Tfh)百分比和白细胞介素21(Interleukin 21,IL-21)的表达,分析Tfh细胞百分比、IL-21与RA患者临床实验室检查指标的相关性;观察氧化苦参碱(oxymatrine,OMT)对CIA小鼠脾脏Tfh细胞百分比的影响,对血清IL-21、Ⅱ型胶原特异性抗体(Collagen type II antibody,CII-Ab)及关节组织TLR2(Toll-like receptor 2,TLR2)、TLR9、CXC趋化因子受体5(CXC Chemokine Receptor 5,CXCR5)表达的影响,探讨氧化苦参碱经由调节Tfh细胞发挥抗RA的机制,为未来投入到临床RA治疗提供实验依据。方法(1)于2016年11月至2017年7月收集宁夏医科大学总医院30例初发RA患者,并选择年龄、性别无统计学差异的健康人作为正常对照。(1)用流式细胞术检测患者外周血Tfh细胞的表型和百分比。(2)运用ELISA方法检测RA患者及正常人血清IL-21的表达水平。(3)将Tfh细胞百分比及IL-21表达水平分别与红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、类风湿因子(rheumatoid factor,RF)和抗环瓜氨酸肽抗体(anti-citrullinated protein antibody,ACPA)进行Spearman相关性分析。(2)选用42只健康雄性DBA/1小鼠,采用完全随机分组方法分成6个小组,每组7只,即正常对照组、模型组、阳性药物组(地塞米松磷酸钠注射液)、氧化苦参碱高、中、低组。除正常对照组外,对CIA模型组小鼠均于背部靠后1-2 cm处多点皮下注射牛CⅡ型胶原与完全弗氏佐剂(CFA)等体积混和液0.1ml/只,正常对照组小鼠皮下注射等量生理盐水;造模成功后,每天对药物组进行腹腔注射氧化苦参碱及地塞米松,持续45天后:(1)进行体重、关节肿胀度、关节炎指数评分的动态监测,直至造模结束。(2)采用流式细胞术检测DBA/1小鼠脾脏Tfh细胞的百分比。(3)各组小鼠踝关节组织行HE染色以观察其形态结构的变化。(4)免疫组化法测定小鼠踝关节滑膜组织TLR2、TLR9、CXCR5的蛋白表达。(5)运用ELISA方法检测小鼠血清IL-21、Ⅱ型胶原特异性抗体(CII-Ab)的表达水平。结果(1)初发RA组CD4~+T细胞百分比明显高于正常对照组(p<0.01),RA组CD4~+CXCR5~+T细胞百分比与正常对照组比较无显著差异;RA组CD4~+CXCR5~+PD-1~+Tfh细胞的比例高于正常对照组(p<0.01),从1.36±0.46增加到2.62±0.99。(2)RA组外周血IL-21水平(171.19±19.74)pg/ml显著高于对照组(125.05±7.68)pg/ml,具有统计学差异(p<0.01)。(3)RA患者外周血CD4~+CXCR5~+PD-1~+Tfh细胞百分比及IL-21水平与ESR、RF、ACPA均呈正相关。(4)氧化苦参碱治疗组与CIA模型组比较,关节肿胀度下降(p<0.05),关节炎指数下降(p<0.05)。(5)流式细胞术检测小鼠脾Tfh细胞,结果表明,模型组CD4~+CXCR5~+ICOS~+Tfh细胞的百分比与正常对照组比较有显著差异(p<0.01),从5.72±2.22增加到10.33±2.68;氧化苦参碱高剂量组CD4~+CXCR5~+ICOS~+Tfh细胞百分比与模型组比较差异显著(p<0.01),从10.33±2.68降低到5.85±1.61;氧化苦参碱中剂量组CD4~+CXCR5~+ICOS~+Tfh细胞百分比与模型组比较差异明显(p<0.01),从10.33±2.68降低到6.27±1.63。(6)HE染色显示,与正常组相比,CIA模型组小鼠踝关节的关节腔变薄,与周围界限不清,滑膜细胞增多且层数增厚,可见大量炎症细胞浸润,软骨破坏;氧化苦参碱高剂量组和中剂量组的滑膜组织表面较模型组明显改善,滑膜细胞排列较规则,增生程度减轻。(7)免疫组化方法观察各组小鼠踝关节滑膜组织TLR2、TLR9、CXCR5的表达情况,结果显示,氧化苦参碱高、中、低剂量组TLR2、CXCR5表达均比模型组要低,而氧化苦参碱高剂量组TLR9表达明显,但类似于正常组TLR9表达,氧化苦参碱中剂量组TLR9呈弱表达,而氧化苦参碱低剂量组及模型组TLR9无表达。(8)ELISA法检测结果显示,氧化苦参碱高、中、低剂量组血清IL-21、CII-Ab水平比模型组有所降低(渐近p<0.05)。结论(1)Tfh细胞参与了类风湿关节炎的发生。(2)氧化苦参碱通过调节Tfh细胞发挥抗RA的作用,且可能与TLR2、TLR9的表达有关。