毛发的真皮乳头和真皮鞘中存在着间充质干细胞,它不仅与上皮细胞相互作用决定了毛发周期的自我更新,而且也能为疾病的干细胞移植治疗和组织工程器官的构建提供自体或异体多能干细胞来源。临床研究中发现:间充质干细胞移植治疗组织损伤时,单次移植细胞数量高达到1×109个才能有效发挥治疗作用,而短时间内可获得的细胞数量不足是阻碍其临床应用的瓶颈。因此如何高效扩增具有自我更新能力和多向分化潜能的间充质干细胞,成为干细胞再生医学研究和应用的基础和关键。生长因子是一类可以刺激细胞生长活性的蛋白类成分,参与细胞增殖、分化和迁移等一系列生物学过程。成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)均有促进细胞增殖的作用。但生长因子应用于人毛囊间充质干细胞的体外扩增,仍有待解决的问题:需要选择合适的生长因子种类和剂量,使其在促进人毛囊间充质干细胞增殖的同时保持其干细胞的特性,不向分化和癌变的结局发展。此外,生长因子促进人毛囊间充质干细胞增殖的信号通路还不明确。表皮生长因子(EGF)是一种由53个氨基酸残基组成的肽类物质,它与表皮生长因子受体(EGFR)结合后形成同源二聚体,通过胞内激酶区自身磷酸化,激活下游信号通路,将关键信号分子从细胞膜传导到细胞核内,启动相关基因表达,调控细胞的生物学行为。目前发现EGFR下游与细胞增殖相关的信号通路主要有:Ras-Raf-MAPK-ERK、PI3K-AKT和JAK/STAT信号通路。这些信号通路具有细胞特异性:不同的细胞可以通过上述不同的信号通路发挥生物学作用。本课题组之前的研究发现:表皮细胞生长因子(EGF)在人保持毛囊间充质干细胞多潜能分化特性的同时能显著刺激其增殖。但EGF通过哪条信号通路,促进人毛囊间充质干细胞增殖目前尚不清楚。因此,本研究的目的是阐明EGF促进人毛囊间充质干细胞增殖的下游信号通路,并初步探讨与之先关的细胞周期G1-S期的调控因素。我们用拔取毛发的方法,从人的毛囊中获取间充质干细胞,用免疫荧光染色和流式细胞术对其进行了表面标记的鉴定,用多向诱导分化实验鉴定其多潜能性。用EGF和EGFR抑制剂(AG1478)、PI3K-AKT抑制剂(LY294002)、ERK抑制剂(U0126)以及STAT3抑制剂(STA-21)处理细胞,检测EGF以及这几种抑制剂对人毛囊间充质干细胞增殖的影响和对EGFR及其下游信号通路的激活情况。用western blotting检测人毛囊间充质干细胞EGF及其下游信号通路对细胞周期G1-S期调节相关蛋白表达的影响。研究结果显示:我们从毛囊中分离得到的细胞表达间充质干细胞的标记物:CD90、CD105、CD44、CD73,不表达CD31。这些细胞也具有向骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化的能力,因此是毛囊间充质干细胞。免疫荧光染色和流式细胞术结果也显示毛囊间充质干细胞表达EGFR,并且表达率在98%以上。细胞增殖实验证实1-50 ng/m L EGF可以显著提高毛囊间充质干细胞的增殖能力,但没有剂量效应关系。EGFR抑制剂(AG1478,0.2-5μM),PI3K-AKT抑制剂(LY294002,10-50μM),ERK抑制剂(U0126,2-50μM)和STAT3抑制剂(STA-21,20-50μM)显著抑制EGF引起的毛囊间充质干细胞增殖。Western blotting结果显示加入EGF可以上调p-EGFR、p-ERK和p-AKT蛋白的表达,对p-STAT3没有作用。而且AG1478-2μM,LY294002-10μM,U0126-10μM分别抑制p-EGFR,p-AKT和p-ERK1/2的表达。细胞周期相关实验证实EGF(10ng/m L)可以促进毛囊间充质干细胞从G1期向S期转变,同时上调细胞周期蛋白cyclin D1的表达,下调p16蛋白表达。综上所述,我们的结果证实EGF通过ERK、AKT信号通路,促进人毛囊间充质干细胞增殖。EGF促进人毛囊间充质干细胞的细胞周期从G1期向S期转变,与cyclin D1表达上调和p16表达下调有关。这一发现为毛囊间充质干细胞体外大量扩增提供了新的方法和理论依据,也为毛囊发育和毛发周期的研究奠定了基础。