论文部分内容阅读
实验目的:随着现代工业化的发展,环境污染变得日趋严重,人们通过环境、职业和饮食等多条途径暴露于各种环境污染物中,影响着人类的健康。多环芳烃（PAHs）是环境中常见的污染物之一,广泛存在于我们的生活中。苯并芘（BaP）是多环芳烃（PAHs）中的典型代表,石油,沥青,杂酚油,煤炭燃烧,油烟,烟草烟雾,油炸食物和烧烤食物等均含有较高水平的BaP。长期或短期的大剂量暴露于BaP中会导致诸多的有害效应,如基因损伤、肿瘤和癌症的发生、致畸、免疫抑制和内分泌紊乱等。胚胎的成功着床对正常妊娠十分重要,胚泡植入子宫的过程包括定位、粘附、迁移和侵袭等过程。滋养层细胞（CTB）由胚囊滋养外胚层产生,CTB通过绒毛途径分化成绒毛滋养层细胞（VCTs）,通过细胞增殖融合形成合胞体滋养层,后者保证了胚胎发育基本的营养交换。此外,CTB通过绒毛外途径分化形成绒毛膜外滋养层（EVT）,EVT细胞迁移并侵袭子宫蜕膜,参与形成蜕膜动脉和子宫螺旋动脉,对血管重塑进行调节。绒毛膜外滋养层细胞侵袭迁移不足将导致子宫螺旋动脉重塑障碍和胎盘灌注不足,从而引发子痫前期（PE）、子痫、胎儿宫内生长受限、甚至流产等不良妊娠结局。EVT细胞过度侵袭则会引发侵袭性葡萄胎和绒毛膜癌等疾病。故而,绒毛膜外滋养层细胞适度的迁移和侵袭对正常妊娠起着相当重要的作用。目前关于多环芳烃是否会影响滋养层细胞迁移和侵袭的功能以及其对应的分子机制仍然不清楚,因此,本文研究了苯并芘的代谢终致癌物BPDE对滋养层细胞迁移侵袭功能的影响,并揭示了其分子机制,对于认识PAH导致不良妊娠（如子痫前期）的机制和相应的临床治疗具有一定的意义。实验方法:1.MTT法检测BPDE对细胞活力的影响;利用ROS试剂盒对暴露BPDE后细胞内活性氧自由基进行检测。2.流式细胞术检测暴露BPDE后细胞周期的变化和BPDE对细胞凋亡的影响。3.划痕实验和Trans-well实验检测BPDE对绒毛膜外滋养层细胞迁移的影响。此外,通过Trans-well检测BPDE对细胞侵袭力的抑制作用。与迁移力力检测不同的是,检测细胞侵袭力时,Trans-well小室的膜要提前铺40μL的基质胶。4.利用直接共培养和成管实验检测暴露BPDE后HTR8/SVneo细胞对HUVEC细胞成管的影响。5.利用Q-RT-PCR和Western-Blot实验检测细胞迁移侵袭相关因子FAK,SRC,PI3K,AKT,eNOS,MMP2和Smad2的mRNA和蛋白的差异表达,并通过eNOS检测试剂盒检测BPDE暴露后细胞内eNOS的活力变化。6.通过SC79（AKT激活剂）上调AKT和eNOS后,检测细胞迁移和侵袭能力的变化。7.采用高通量测序技术,检测BPDE诱导SWan71细胞差异表达mi RNA,并利用DAVID软件对mi RNA的靶基因进行生物信息学分析。实验结果:1.MTT实验结果表明暴露不同浓度的BPDE后,HTR8/SVneo和SWan71细胞的细胞活力下降,且随着BPDE的逐渐浓度增加,细胞的活力逐渐下降,呈剂量依赖关系。BPDE浓度为2.0μM时,细胞的活力约下降为50%。HTR8/SVneo细胞内活性氧自由基随着BPDE浓度增加而上升（P*<0.05）。2.细胞周期分析结果表明BPDE导致HTR8/SVneo细胞周期阻滞在G0/G1期。高浓度BPDE（1.5和2.0μM）促进细胞凋亡,而BPDE（0.25、0.5和0.75μM）对细胞凋亡无显著影响。为了排除细胞凋亡对细胞迁移和侵袭的影响,因此在后续的Trans-well和划痕实验中选择了1.0μM作为BPDE处理的最大浓度。3.BPDE抑制细胞的迁移和侵袭能力。划痕实验结果表明BPDE暴露导致HTR8/SVneo细胞的迁移能力下降。Trans-well实验进一步验证了上述结果,Trans-well实验结果显示随着BPDE浓度升高,迁移透过膜的细胞数逐渐减少。此外,BPDE抑制了HTR8/SVneo细胞的侵袭能力,随着BPDE浓度升高,侵袭穿透过膜的细胞数逐渐减少,BPDE低浓度（0.25μM）时,细胞的侵袭能力已经被明显抑制（P**<0.01）。4.BPDE处理HTR8/SVneo后导致HTR8/SVneo与HUVEC细胞间的相互作用减弱。HTR8/SVneo细胞暴露BPDE后,HTR8/SVneo细胞消化下来与HUVECs进行共培养。与实验组相比,HUVECs细胞的成管长度减少,并且成管长度与HTR8/SVneo暴露的BPDE浓度成反比。5.Western-Blot和Q-RT-PCR结果表明暴露BPDE后,FAK、SRC、PI3K、AKT、e NOS、MMP2的mRNA和蛋白水平下降,说明BPDE抑制FAK、SRC和PI3K,下调PI3K-AKT-e NOS通路从而抑制绒毛膜外滋养层细胞的迁移侵袭功能。6.与单独暴露1.0μM BPDE相比,BPDE联合SC79（10μM）暴露可部分减弱BPDE对HTR8/SVneo细胞侵袭迁移的抑制作用。7.BPDE暴露诱导SWan71细胞差异表达mi RNA,其中mi RNA-193b-3p和novelmir18可能参与BPDE对SWan71细胞侵袭迁移的调控。研究结论:我们的研究发现BPDE抑制了绒毛膜外滋养层细胞HTR8/SVne和SWan71的迁移和侵袭能力。HTR8/SVneo细胞中FAK/SRC表达的下调,减弱了对PI3K的招募,进而导致PI3K/AKT/e NOS信号通路受到抑制。因此,BPDE通过FAK/SRC/PI3K/AKT/e NOS/MMP2途径抑制滋养层细胞HTR8/SVne的迁移和侵袭。BPDE暴露诱导SWan71细胞差异上调44个已知的miRNA,下调55个已知的miRNA;差异上调6个novel-miRNA,下调20个novel-miRNA。其中mi RNA-193b-3p和novelmir18可能参与BPDE对SWan71细胞侵袭迁移的调控。本研究揭示了多环芳烃对绒毛膜外滋养层细胞侵袭迁移能力的抑制和相应的分子机制,提示多环芳烃可能通过抑制绒毛膜外滋养层细胞的迁移和侵袭能力,从而影响胚胎的正常着床,导致不能妊娠结局,为进一步研究多环芳烃的女性生殖毒性提供了分子机制。