邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(di-2-ethylhexyl phthalate,DEHP)是使用最普遍的一种增塑剂,广泛用于食品包装、化妆品、建筑材料、儿童玩具等领域,可增加塑料制品的延展性和柔韧度。研究表明DEHP是一种环境内分泌干扰物(environmental endocrine disruptors,EEDs),具有类似雌激素的作用,进入机体后会干扰体内正常内分泌物质的合成、释放、转运及代谢过程,从而破坏人体内环境的稳定。大量流行病学资料和动物实验证实,DEHP具有生殖毒性、胚胎发育毒性、神经毒性、免疫毒性等,进入体内会引发多器官的损伤。我国DEHP用量大、使用范围广,因由此带来的环境和健康问题不容忽视。本实验从孕中期起通过灌胃方式给予Wistar大鼠不同剂量DEHP溶液,建立了简便、有效的妊娠中、晚期DEHP毒性评价系统,以观察胎鼠生长发育的情况。将大鼠胎盘作为核心组织,对相关分子在基因和蛋白水平进行检测,为阐明DEHP胚胎发育毒性的作用机制提供理论依据。目的1、孕中晚期通过灌胃给予Wistar大鼠不同剂量的DEHP溶液,建立妊娠中晚期大鼠DEHP染毒模型。2、探讨孕中晚期不同剂量DEHP暴露对大鼠胎盘组织形态学和超微结构的影响。3、探讨孕中晚期不同剂量DEHP暴露对胎鼠生长发育的影响。4、探讨DEHP胚胎发育毒性的作用机制。方法1、将60只雌性Wistar大鼠随机分为4组:对照组(玉米油)、低剂量组(100mg/kg)、中剂量组(500mg/kg)和高剂量组(1000mg/kg)。妊娠11日起孕鼠每日灌胃给予DEHP溶液,妊娠第19日处死母鼠,观察大鼠孕期一般情况。2、记录各剂量组胎鼠数量,计数活胎数、死胎数和畸胎数,测量胎鼠体重、身长和尾长,计算胎鼠心、肝、肾脏器系数。3、测量胎盘质量,取胎盘组织分别做HE染色和电镜制片,观察不同组间胎盘形态学和超微结构的变化。4、选用大鼠全基因组表达谱芯片检测高剂量组和对照组间基因的变化,将差异表达基因按功能和通路进行分类。5、荧光定量PCR验证部分差异基因WT1、PPARα、FX、HNF1a、SFRP2、SPP1和AREG m RNA水平的变化。6、检测过氧化物酶体增殖物激活受体PPARs的三个亚型和视黄醛X受体αm RNA和蛋白水平的变化。7、选取PPARs下游通路中脂代谢相关分子FATP4、FABPs、FAT/CD36、CPT1A、ACOX-1、SCD-1、LPL、EL,检测它们m RNA水平和蛋白水平的变化。结果1、DEHP灌胃后各组孕鼠一般情况良好,无流产和早产,无动物死亡。中和高剂量组孕鼠体重增加缓慢。2、光镜结果显示低剂量组胎盘结构无明显改变,中和高剂量组胎盘结构的改变主要在迷路带和海绵滋养层。表现为海绵滋养层变薄,细胞变性、坏死,迷路带扩张淤血。高剂量组胎盘改变最显著。3、电镜下各剂量组胎盘超微结构的改变主要表现在微绒毛、线粒体和内质网等细胞器的变化。高剂量组胎盘滋养层细胞结构破坏,出现明显的凋亡小体。4、中和高剂量组胎鼠畸形率和死亡率明显升高。胎鼠体重减轻,身长和尾长变小,生长受限。胎鼠肝和肾的脏器系数减小。5、高剂量组和对照组相比,基因芯片共检出表达大于2倍以上差异基因951个,其中表达上调基因424个,表达下调基因527个。6、对筛选出的差异表达基因进行GO功能分析,上调基因主要参与的生物学过程包括:组织发育、创伤修复、甾体类激素代谢、应激反应等。下调基因主要参与类固醇代谢、有机物的转运、脂代谢等。7、应用KEGG pathway数据库分析,上调最显著的pathway是刺激神经的配体-受体和细胞因子-细胞因子受体。下调最显著的pathway是补体和凝血级联反应、脂肪的消化和吸收。8、荧光定量PCR验证,WT1、PPARα和AREG m RNA的表达上调,FX、HNF1a、SFRP2、SPP1的表达下调。与芯片结果一致。9、RXEα、PPARα和PPARγ在基因水平和蛋白水平随着染毒剂量的增加,表达增强。PPARβ的表达无变化。10、FATP4、FABPs和FAT/CD36蛋白水平的表达在中和高剂量组明显升高,高剂量组表达量最高。FATP4、FABPs、FAT/CD36、CPT1A、ACOX-1、SCD-1、LPL、ELm RNA的表达呈递增趋势,高剂量组升高显著。结论1、妊娠中晚期DEHP暴露可影响胎盘及胚胎的发育,导致不良妊娠结局。2、DEHP对胎盘和胎儿的损伤具有明显的剂量-反应关系,1000mg/kg DEHP暴露剂量对胎儿影响最大。3、DEHP对胚胎发育的影响涉及多个基因、多条通路,是多因素共同作用的结果。每个基因的功能并不是独立存在的,各基因之间相互联系、相互作用,共同组成了一个错综复杂的网络。4、DEHP可能通过激活PPARs影响胎盘脂代谢通路,最终导致胚胎发育异常。