【摘 要】
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目的结核病是目前全球范围内由单一微生物感染引起的死亡率最高的传染病。寻找新的抗结核基因药靶,研发新型抗结核药物,特别是可以抑制持续感染过程中的结核杆菌的有效药物是
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目的结核病是目前全球范围内由单一微生物感染引起的死亡率最高的传染病。寻找新的抗结核基因药靶,研发新型抗结核药物,特别是可以抑制持续感染过程中的结核杆菌的有效药物是当前抗结核研究的重要课题之一。我们选择结核分枝杆菌持续感染代谢途径中的关键酶---异柠檬酸裂解酶(Isocitrate Lyase,ICL)作为研究开发新型药物的作用靶点,克隆表达具有生物学活性的结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶重组蛋白,并对其结构、分子量及酶学性质等进行了研究,为以异柠檬酸裂解酶为靶点的抗结核药物筛选奠定基础。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,扩增该菌株的异柠檬酸裂解酶基因icl;以pUC18载体克隆该基因,再将其克隆入原核表达载体pET-28a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白,通过表达条件的优化得到可溶性重组蛋白;以镍离子螯合型琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化,以获得纯化的结核分枝杆菌H37Rv异柠檬酸裂解酶重组蛋白;通过圆二色及质谱分析对其结构及分子质量进行测定。以时实波长扫描对重组蛋白的酶学性质进行测定分析。结果对重组质粒测序结果证明所克隆的基因与GenBank里公布的异柠檬酸裂解酶序列一致;电泳结果证明得到了纯化的50KD左右的蛋白。通过酶学方法检测该重组蛋白证明其具有异柠檬酸裂解酶活性;酶学性质测定分析表明:重组异柠檬酸裂解酶ICL的比活力为7.657×102μmol.mg-1min-1,反应最适
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