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研究目的：糖尿病视网膜病变(DR)是40岁以上人群的主要致盲眼病之一。2010年以人群为基础的流行病学调查发现有1/3的糖尿病患者会出现糖尿病体征,1/10的糖尿病患者会出现威胁视力的并发症,比如糖尿病黄斑水肿(DME)或者增殖期糖尿病视网膜病变(PDR)。糖尿病视网膜病变增殖膜形成会对视网膜造成严重的牵拉因而成为糖尿病视网膜病变晚期严重并发症之一,目前手术是唯一有效的治疗方法。但是如何鉴别增殖膜的活性,合理评价手术指证是一项需要解决的临床问题。本实验的目的是通过对增殖膜的活性进行分析,筛选与增殖膜活力相关的miRNA,并进一步探讨其作用及可能的信号通路。1.研究内容及方法增殖膜增殖活力的验证,选择手术中切除的增殖膜标本,应用免疫组织化学的方法,对增殖膜进行染色,根据Ki-67染色的结果,评估增殖膜的增殖活力。2.miRNA芯片筛选,选择Ki67高表达和Ki67(-)患者的玻璃体液标本进行miRNA芯片分析,筛选出与细胞增殖,迁移和新生血管相关的miRNA。3.应用高糖刺激研究RPE细胞miR-451a表达水平的改变4.miRNA的生物学功能,ARPE-19细胞系转染miR-451a mimics, mimics-control, miR-451a antagomir, antagomir NC,通过MTT, CCK8,细胞划痕实验,研究miR-451a对RPE细胞增殖和迁移方面的作用。5.根据生物信息学的基本原理,对miR-451a的靶标进行预测,进一步通过PCR,western Blot,双荧光酶报告基因验证ATF-2与miR-451a之间的关系6.应用PCR的方法,验证下游细胞通路7.统计学分析采用SPSS13.0软件。细胞荧光定量PCR结果比较采用2-△△Ct值,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。方差不齐时采用We|ch近似方差分析；方差齐性的多重比较采用LSD法,方差不齐时采用Dunnett’S T3法。研究结果：1.增殖膜的增殖系数平均为4.18%±4.58%(0%-16.67%),Ki-67(+)增殖膜患者占78.6%。2.通过microRNA基因芯片分析的结果,83个miRNA中仅16个miRNAKi-67(+)低于Ki-67(-)患者,且表达差异小于2倍：其余67个miRNA中Ki-67(+)高于Ki-67(-)。表达差异最大的1niR-451a,Ki-67(+)是Ki-67(-)的32.89728倍。3.体外实验高糖刺激RPE细胞24,48小时miR-451a的表达水平高于正常对照,具有统计学意义(P=0.02,0.022),至72小时miR-451a与对照组不存在统计学意义(P=0.531)。4.MTT实验表明,24小时和48小时,miR-451a mimics可以抑制细胞的增殖(P<0.05)。48小时inhibitor可以促进细胞的增殖(P<0.05)。CCK-8实验表明：24小时及48小时miR-451a可以抑制细胞增殖(P=0.036,0.018),而inhibtior可以促进细胞增殖(P=0.041,0.015)。划痕实验表明,24小时及36小时miR-451 inhibitor可以促进ARPE-19细胞的迁移(P=0.029,0.022)。5.双荧光素酶报告基因系统,psiCHECK-2/ATF-2 3’UTR分别和miR-451a mimics, mimics control共转染,psiCHECK-2空载体和miR-451a mimics共转染后,可以改变荧光活性(F=63.041,P=0.000),表明miR-451aa可以和ATF-2的3’UTR区域结合。miR-451a mimics和inhibitor转染细胞,在24h和48h通过PCR检测时,miR-451a表达水平的变化可以调节ATF-2 mRNA的表达(F=50.645,F=59.898:P=0.000,P=0.000).Western Blot显示在转染后48小时,miR-451a表达水平的变化可以调节ATF-2蛋白的表达(F=16.626,p=0.000)。6.PCR结果显示miR-451a表达水平改变后,基质金属蛋白酶2,细胞周期素A1,细胞周期素Dl在48小时和72小时表达水平相应变化。48小时及72小时CyclinDl各组间表达差异具有统计学意义(F=14.113,10.223；P=0.000,0.000)。CyclinAl(F=17.143,46.382；P=0.000,0.000),MMP2各组间表达差异具有统计学意义(F=18.549,13.865；P=0.000,0.000)。PDGFRa的2-△△CT大于30,未进行统计。结论：1.通过免疫组织化学及芯片分析得出,并非所有的糖尿病增殖膜细胞均具有增殖活性,miR-451a可能与细胞增殖膜活性相关；2.体外实验,高糖可以促进miR-451a的表达,升高miR-451a的表达水平可以抑制RPE的增殖,降低miR-451a的表达水平可以促进RPE的细胞的增殖和迁移：3.初步验证miR-451a/ATF-2/MMP2,CyclinAl,CyclinD1可能是影响RPE细胞增殖和迁移的信号通路。