本研究是本室构建抗体库平台的一个组成部分。通过鼠源性人肿瘤单链抗体库的构建及肿瘤相关抗体的筛选,旨在有助于本室更好地开展肿瘤分子生物学的研究工作,有助于肿瘤的诊断与治疗。 实验首先用乳腺癌细胞系MCF-7、T47D、MDA-MB-435免疫BALB/c小鼠,待达到合适免疫效价后取鼠脾脏淋巴细胞提取总RNA,通过RT-PCR反转录成cDNA,利用鼠V_H、V_L特异性引物扩增出V_H、V_L cDNA,并用Linker连接V_H、V_L,构成单链抗体(scFv)基因片段,随后将单链抗体(scFv)基因片段插入pCANTAB 5E载体,电转化TG1菌,获得库容为1.3x10~6的单链抗体库。 在用抗体库筛选实验中,主要选乳腺癌细胞系MCF-7和人正常肝细胞系HL02做正负差异筛选模型,运用固相和液相筛选方法,筛选到两株肿瘤相关抗体:scFv-873和scFv-874。通过数据库搜索,发现这两株单链抗体基因是与以往抗体序列不同的新基因。 将含这两种抗体基因的噬菌粒载体转入琥珀密码子非抑制型菌株T0P10中,诱导表达后,用Western blot检测,scFv-874具有明显的分泌性表达,并且在周质及全细胞中都可以表达;而scFv-873未检测出明显的分泌性表达,只在全细胞中可以表达。遂将这两个scFvs基因插入pTIG-Trx表达载体中,在BL21(DE3)中实现了游离形式的可溶性表达,并经镍柱(Ni-NTA)得到有效纯化。 本研究获得了针对人肿瘤细胞的相关抗体,并实现了可溶性表达和纯化,为下一步工作奠定了基础,并探索了符合本实验室实际情况的抗体库技术平台的构建路线,为肿瘤特别是乳腺癌的早期诊断和治疗奠定了基础。整个研究也符合本实验室肿瘤分子生物学研究的方向,有助于更好地开展相关工作。