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目的:钙化性纳米微粒(calcifying nanoparticles,CNPs)在肾结石形成过程中起到重要的作用,但其确切的作用机制目前仍不清楚。本文旨在探讨草酸钙肾结石患者中段尿中培养的CNPs对肾小管上皮细胞的损伤作用及其机制,从而了解CNPs在肾结石形成过程中起到的作用。方法:收集草酸钙肾结石患者(n=20)及健康人(n=10)中段尿进行体外培养并分离CNPs;应用透射电子显微镜(transmission electron microscopy TEM)、扫描电子显微镜(scanning electron microscopy SEM)分析CNPs的形态特征及其内部结构,X-射线能谱分析(energy-dispersive X-ray microanalysis EDX)分析CNPs的主要元素组成,免疫印迹法(Western blotting WB)检测CNPs中胎球蛋白A的表达情况,通过电泳和布朗运动视频分析观察培养的CNPs的粒径分布及其电位情况。通过透射电镜观察草酸钙结石患者肾乳头钙化斑中CNPs存在情况。CNPs(2 MCF)与肾小管上皮细胞(HK-2)分别共培养0h,12h及72h后通过CCK-8(The Cell Counting Kit-8)检测细胞活性,并用流式细胞仪检测活性氧(Reactive oxygen species ROS)的表达情况、线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential MMP)的变化。Ad-mRFP-GFP-LC3双标腺病毒转染后的HK-2与CNPs共培养12h后通过激光共聚焦显微镜观察HK-2的自噬流变化情况。CNPs干预72小时后流式细胞仪测定细胞凋亡率。CNPs干预后通过TEM观察HK-2细胞超微结构变化并观察HK-2的自噬和凋亡现象。WB分析细胞内蛋白水平的变化。结果:1、从草酸钙结石患者的中段尿中可以培养出CNPs,经多种方法鉴定其形态与经典描述一致。CNPs的粒径集中在130nm左右,并检测出CNPs具有负电位。CNPs中包含胎球蛋白-A(Fetuin-A)。在肾乳头钙化斑的超薄切片中可以观察到与培养的CNPs形态具有高度的相似性;2、CCK-8检测结果显示CNPs干预后HK-2的细胞活力随干预的时间增加下降。流式细胞术检测结果提示CNPs可诱导细胞内ROS产生,并检测到HK-2的线粒体膜电位下降。3、我们通过Ad-mRFP-GFP-LC3腺病毒转染实验观察到CNPs干预的早期(12h)HK-2既可以发生自噬现象。流式细胞术检测到CNPs干预72h后细胞出现细胞凋亡情况。细胞超薄切片透射电子显微镜图像显示HK-2可以通过吞噬作用内吞CNPs,细胞内的CNPs包裹于囊泡内,细胞线粒体肿胀,并可以观察到自噬、细胞凋亡及细胞坏死等征象。4、CNPs干预后Bcl-2蛋白的表达下降,而Bax的表达明显升高,自噬指示蛋白LC3-B和Beclin-1表达水平明显增高,通路蛋白p-JNK/JNK表达水平增加(12h)。结论:1、草酸钙肾结石患者的中段尿中可以培养出CNPs,中段尿的培养可以作为泌尿系有无感染CNPs的方法;CNPs可以通过内吞囊泡的方式进入HK-2细胞,CNPs的负电位可能在内吞过程中起到作用;2、CNPs为晶体蛋白复合物,其复制增殖是一种以蛋白为载体的钙磷沉积仿生行为;3、吞噬后的CNPs可通过作用于线粒体诱导细胞内ROS的产生;4、CNPs诱导ROS的过度表达可导致HK-2的自噬与凋亡,严重时还可以引起细胞的坏死;5、CNPs在草酸钙肾结石肾乳头钙斑的形成中起着重要的作用,CNPs的持续钙磷沉积是钙斑中磷酸钙核心形成的基础;6、ROS-JNK通路在CNPs诱导HK-2细胞损伤中起着关键的调控作用。