荔枝蝽平腹小蜂(Anastatus japonicus)是用于生物防治的膜翅目寄生蜂,该蜂把子代卵产在寄主卵内,利用寄主卵内的营养物质进行生长发育,最终将寄主卵破坏,达到防治的目的。常用于防治荔枝、龙眼的主要害虫荔枝蝽象(Tessaratoma papillosa),因其对农作物无害,不造成环境污染,有利于保持生态平衡,达到持久的害虫防治的效果而被广泛应用。提高荔枝蝽平腹小蜂在田间的生防效率,了解荔枝蝽平腹小蜂的寄主搜寻机制,进而实现有效的田间释放成为研究的关键。本文通过转录组测序鉴定出荔枝蝽平腹小蜂的气味受体和离子交换受体,并对其在小蜂各组织器官中的表达特征进行了研究;初步筛选出了在寄主搜寻过程中发挥明显吸引或者趋避作用的化学信息素物质;利用分子生物学、行为学等方法,证明了荔枝蝽平腹小蜂的寄主搜寻行为与外周嗅觉感受器相关,并且主要与嗅觉共受体Orco有关,与离子交换共受体IR8a和IR25a无关;本研究首次对小蜂在寄主搜寻过程中功能性化学信息素物质的嗅觉受体进行定位。主要结果如下:(1)荔枝蝽平腹小蜂在寄主搜寻过程中相关化学信息素物质的鉴定本实验首先对小蜂的发育历期进行监测,包括卵期2天、幼虫期4天、预蛹期4-5天、蛹期9-10天。其中从蛹期末期变成成虫后,到成虫破壳而出只有不到24小时,此时小蜂的嗅觉系统尚未发育成熟,因此,在出蜂后马上进行RNA干扰,保证了干扰的成功率;然后,从以往研究的寄主植物以及寄主昆虫的GC-MS数据中选取29种相关化学信息素物质,进行荔枝蝽平腹小蜂的电生理学和产卵测定,发现了8种具有显着的EAG反应的物质,其中β-Carophyllene,Undecane,(E)-α-Famesene,(+)-Aromadendrene和Cis-3-Hexen-ol具有显著的吸引作用,以及α-Carophyllene,2-Ethyl-1-Hexan-ol和Ethyl Acetate具有趋避作用的物质。这些物质可能在小蜂寄主搜索定位中起作用,可用于后续实验,即鉴定荔枝蝽平腹小蜂寄主搜索定位中起作用的功能性受体。(2)基于荔枝蝽平腹小蜂触角转录组数据的ORs和IRs的鉴定与筛选以往的研究表明,昆虫在寄主搜寻过程的气味识别,主要与气味受体(ORs)以及离子交换受体(IRs)有关,要想进一步确定在荔枝蝽平腹小蜂寄主搜寻行为中起作用的相关嗅觉通路,首先需要获得相关的基因序列。通过转录组测序,我们得到92,499条Transcript和70,473条Unigene,从中筛选到气味受体165个,其中全长序列48个,包括嗅觉共受体Orco序列以及普通气味受体AjapOr1-AjapOr47序列;离子交换受体13个,其中全长序列9个,包括离子交换共受体IR8a和IR25a序列以及AjapIR68a,AjapIR3,Ajap64a1,Ajap64a2,AjapIR6,Ajap76b和Ajap93a。分别与膜翅目其他物种的相应氨基酸序列构建系统发育树,分析其同源性。以往的研究认为,寄主搜寻行为中的气味识别可能与ORs嗅觉通路有关。借助RT-PCR对AjapORs和AjapIRs基因在成虫不同组织部位的特异性表达情况进行鉴定,并结合转录组数据库中的FPKM值,筛选出既为触角特异性表达又表达量较高的AjapOR基因,包括AjapOR10,AjapOR11,AjapOR20,AjapOR27,AjapOR29,AjapOR33,AjapOR34以及AjapOR35共8种,这些基因可能直接参与昆虫嗅觉感受,在识别外界气味分子的过程中起到重要性作用,因此,这8种基因的筛选为进一步功能性化学信息素物质的嗅觉受体鉴定提供了可能。(3)荔枝蝽平腹小蜂寄主搜寻行为中相关嗅觉通路的确定利用转录组测序得到的Orco,IR8a和IR25a三种共受体基因的已知序列,合成dsRNA,进行RNA干扰。qPCR验证结果显示,与未注射组和注射dsGFP组这两个对照组相比,注射dsOrco,dsIR8a以及dsIR25a的实验组,嗅觉基因的表达量在注射5天后有明显降低,说明随着时间增加,成虫体内的dsRNA对嗅觉组织中的这三种基因的mRNA表达起到了明显的抑制作用,说明RNA干扰成功。然后,将基因沉默后的荔枝蝽平腹小蜂进行寄生功能反应以及搜寻时间实验,结果表明,与两个对照组相比,注射dsIR8a以及dsIR25a的实验组寄生率和搜寻时间没有明显变化,然而,注射dsOrco的实验组寄生率却发生了显著的下降,有趣的是,AjapOrco沉默组搜寻第一枚卵所需的时间长于其他组所需要的时间,并且我们的观察表明AjapOrco沉默组中的某些个体花费了很长时间来搜寻合适的卵,即使他们最终找到卵,这些个体更可能是通过接触感觉而不是嗅觉来定位产卵。这些结果表明,荔枝蝽平腹小蜂的寄主搜寻和产卵过程中的嗅觉感应主要依赖于ORs相关途径而不是IRs相关途径。与两个对照组相比,注射dsOrco,dsIR8a以及dsIR25a的实验组的寻找效应均没有明显变化,说明荔枝蝽平腹小蜂自身密度对寻找效应的影响与嗅觉共受体Orco以及离子交换共受体IR8a,IR25a无关。(4)荔枝蝽平腹小蜂的嗅觉受体定位上述实验中,我们发现小蜂在寄主搜寻过程中Orco通路行使气味识别作用,为了进一步确定与搜寻行为相关化学信息素物质被哪种具体的气味受体相识别,本实验将之前筛选出的在触角中含量较高并特异性表达的8个OR氨基酸序列,进行功能性化学信息素物质的嗅觉受体鉴定,基因沉默后的小蜂的触角EAG测定结果显示,对其具有明显的吸引作用的物质中(E)-α-Famesene和β-Carophyllene可能与嗅觉受体AjapOR35特异性结合,进一步的产卵实验结果表明,(E)-α-Famesene和β-Carophyllene的产卵吸引效应在AjapOR35沉默后消失,说明存在于寄主植物这些起吸引作用的物质可以诱导荔枝蝽平腹小蜂的定位产卵,AjapOR35与其的嗅觉定位和产卵行为有关。总之,本文以荔枝蝽平腹小蜂为材料,对其气味受体和离子交换受体的表达特征进行研究,并发现在其寄主搜寻行为中嗅觉共受体Orco可能起到气味识别作用,为完善昆虫的嗅觉机制奠定了基础;同时,初步发现在寄主搜寻过程中,具有明显吸引作用的(E)-α-Famesene和β-Carophyllene物质的识别可能与普通气味受体OR35有关,这有助于我们更好的理解荔枝蝽平腹小蜂的寄生产卵行为的分子机制,进而改善生物防治方法,为提高田间生物防治效果奠定了基础。